補骨脂酚緩釋片Beagle犬體內藥代動力學研究*

★ 洪建華 雷志強（.南昌大學附屬口腔醫院/江西省口腔生物醫學重點實驗室 南昌330006；2.江西中醫藥大學 南昌 330004）

補骨脂酚是補骨脂中提取出的一種含量較高的單萜酚類化合物。本課題組前期藥理研究表明補骨脂酚具一定植物雌激素活性，能同時激活ERα和ERβ轉錄活性，但對ERβ的激活大于ERα［1］。而激活ERβ的藥物被認為是長期使用雌激素治療雌激素相關疾病的更安全的替代品。結果揭示補骨脂酚在治療婦女更年期綜合征及其它與雌激素相關疾病方面可能是一個具良好開發前景的候選藥物。

但補骨脂酚為水難溶性藥物，在體內難以吸收，生物利用度低，本課題為增加補骨脂酚的溶解度和溶出速率，且維持穩定的體內血藥濃度，利用固體分散及緩釋制劑的技術將其制成補骨脂酚緩釋片。

為了解補骨脂酚緩釋片在Beagle犬體內的藥代動力學特征，揭示其體內的緩釋特征，本文擬建立Beagle犬血漿中補骨脂酚濃度的含量測定方法，考察了緩釋片在犬體內的藥動學特征，為新藥開發奠定基礎，保證補骨脂臨床用藥的有效性和安全性。

1 實驗材料

1.1 儀器 Waters 515液相色譜儀，配置一元泵，手動進樣器及Waters 2487檢測器（美國，Waters公司），Empower數據處理軟件。色譜柱：Hypersil ODS2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm；中國，大連依利特分析測試公司）。

1.2 試藥與試劑 補骨脂酚為本實驗室制得，HPLC歸一化結果顯示純度均大于98%，結構經NMR及MS鑒定；甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；冰醋酸（色譜純，天津市精細化工研究所）；超純水為Millipore超純水凈化系統制得（美國，Millopore公司）；乙酸乙酯（分析純，天津市化學試劑一廠）。

2 方法

2.1 色譜分析條件 流動相：0.2%冰醋酸水溶液（A）-甲醇（B）（10∶90）；流速：1mL/min。檢測波長：260nm。柱溫：室溫。進樣量：10μL。

2.2 數據分析軟件 利用SPSS 11.5軟件進行統計分析。

2.3 對照品溶液的配制 精密稱取補骨脂酚對照品4.632mg，置于100mL容量瓶中，少量甲醇溶解后，再用甲醇定容至刻度，配制成濃度為4.632μg/mL的儲備液置于冰箱中備用。取上述儲備液適量，用甲醇配成含補骨脂酚如下濃度的系列工作液：6.948，14.988，46.32，92.64，185.28，463.2 ng/mL。將上述儲備液及工作液置于4℃冰箱中保存備用。

2.4 血漿樣品的處理方法 冰凍犬血漿于水浴中融化，溫度回至室溫，再渦旋1min。取犬血漿200μL于1.5mL離心管內，渦旋混勻器上混勻30s，加入1mL的乙酸乙酯提取液，繼續渦旋1min，將樣品置于離心機中，4℃下14000 rpm離心10min，移取上層有機相至干凈的1.5mL離心管中，于40℃水浴，空氣吹干。殘渣加入100μL甲醇，渦旋混勻器上震蕩30s，超聲1min，將溶解液置于離心機中，4℃下14000 rpm離心5min，取上清液10μL注入HPLC色譜儀，記錄補骨脂酚的峰面積。

2.5 方法驗證

2.5.1 專屬性試驗 分別取6只犬空白血漿各200μL，按“2.4 血漿樣品的處理方法”項下操作，進樣測定，獲得空白血漿色譜圖。取上述混合空白血漿，加入某一濃度混合工作液溶液50μL，其余按“2.4 血漿樣品的處理方法”項下操作，進樣測定，獲得空白血漿外加對照品色譜圖。

取健康犬灌胃給予補骨脂酚部位后的血漿樣品，按“2.4 血漿樣品的處理方法”項下操作，進樣測定，獲得給藥后的血漿樣品色譜圖。

2.5.2 標準曲線的繪制、最低定量限的測定 取1.5mL的離心管，加入200μL的空白犬血漿，精密吸取50μL的補骨脂酚系列工作液，配成含補骨脂酚濃度為1.737，3.747，11.580，23.160，46.320，115.800 ng/mL 的血漿標準濃度溶液。渦旋混勻30s，按“2.4 血漿樣品的處理方法”項下操作。以補骨脂酚在血漿中的標準濃度（C）為橫坐標，補骨脂酚的峰面積（/103）為縱坐標進行線性回歸。連續測定3分析批次。

2.5.3 精密度、準確性試驗 日內精密度：按標準曲線項下操作，配制補骨脂酚濃度為46.320，23.160，3.747ng/mL的高、中、低三種不同濃度的犬血漿樣品，按“2.4血漿樣品的處理方法”項下操作，HPLC分析，記錄補骨脂酚的峰面積，代入隨行標準曲線中求算濃度。一天內每個濃度各做5份。

日間精密度：按日內精密度項下操作，每天將補骨脂酚的高、中、低三種不同濃度的血漿樣品各做5份，按“2.4 血漿樣品的處理方法”項下操作，HPLC分析，記錄補骨脂酚的峰面積，代入隨行標準曲線中求算濃度，連續測定3天。

2.5.4 提取回收率的測定 取1.5mL的離心管，加入200μL的空白犬血漿，精密吸取50μL的補骨脂酚工作液，配制補骨脂酚濃度為46.320，23.160，3.747ng/mL的高、中、低三種不同濃度的犬血漿樣品各5份，加入1mL乙酸乙酯，渦旋1min，靜置5min，將樣品置于離心機中，4℃下14000 rpm離心10min，移取上層有機相至干凈的1.5mL離心管中，于40℃水浴，空氣吹干。殘渣加入100μL甲醇，渦旋混勻器上震蕩2min，超聲5min，將溶解液置于離心機中，4℃下14000 rpm離心5min，取上清液10μL注入HPLC色譜儀，記錄補骨脂酚的峰面積（As0）。

另取1.5mL的離心管，精密吸取不同量的補骨脂酚工作液，配制補骨脂酚濃度為46.320，23.160，3.747ng/mL的高、中、低三種不同濃度的樣品，渦旋混勻，于40℃水浴，空氣吹干。殘渣加入100μL甲醇，渦旋混勻器上震蕩2min，超聲5min，將溶解液置于離心機中，4℃下14000 rpm離心5min，取上清液10μL注入HPLC色譜儀，記錄補骨脂酚的峰面積（As1），按下式計算樣品提取回收率：

回收率 /%=（As0）/（As1）×100%

2.5.5 穩定性試驗 按標準曲線項下操作，配制含補骨脂酚濃度為23.160ng/mL的中濃度犬血漿樣品，其中3份中濃度的犬血漿樣品室溫下放置4h，按“2.4血漿樣品的處理方法”項下操作，進行HPLC分析；其中3份中濃度的犬血漿樣品室溫下放置8h，按“2.4血漿樣品的處理方法”項下操作，進行HPLC分析；其中3份中濃度的犬血漿樣品置于-20℃冰箱24h后，用37℃的水化凍，按“2.4血漿樣品的處理方法”項下操作，進行HPLC分析；其中3份中濃度的犬血漿樣品置于-20℃冰箱每24h，用37℃的水化凍3次，按“2.4血漿樣品的處理方法”項下操作，進行HPLC分析；另外也進行處理樣品在20℃下自動進樣器樣品盤中放置0h和24h的穩定性。

2.6 補骨脂酚犬血漿中移行情況研究

2.6.1 補骨脂緩釋片的制備 補骨脂酚固體分散體的制備：按處方補骨脂酚∶PVP∶磷脂=1∶2∶0.5，依下列步驟將補骨脂酚制備成固體分散體。

補骨脂酚緩釋片的制備：依下列步驟將補骨脂酚固體分散體制備成緩釋片。

包衣液的配置：包衣液HPMC∶PEG∶IV丙烯酸樹脂∶乙醇∶水=2.5∶0.7∶4∶75.8∶18。

2.6.2 動物 Beagle犬6只，普通級，雌雄各半，體質量（10.12±0.5868）kg，購自北京瑪斯生物技術有限公司提供，生產許可證：SCXK（京）2011-0003；質量合格證明：11400600000228。

2.6.3 給藥劑量的選擇 結合補骨脂的藥理作用、藥材中的補骨脂酚含量及補骨脂在臨床上的用藥劑量（6～9g/60kg），經過預試驗，補骨脂酚緩釋片犬給藥的劑量為：每只犬給予1片，每片含補骨脂酚120mg。

2.6.4 給藥與取樣 試驗過程遵循實驗動物飼養和使用的相關規定。試驗前犬飼養于恒溫恒濕動物房中，給藥前自由攝食、攝水。Beagle犬6只，給藥前均禁食12h，灌胃給藥。于給藥前、后0.0833、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5、7、10、12、15、24h前肢靜脈采血 2 mL左右于真空采血管中，4000 rpm離5min，分離出血漿，于-20℃保存待測。按上述所建立的血漿樣品處理方法處理血漿樣品，經HPLC法測定各時間點的補骨脂酚的藥物濃度。

3 結果

3.1 方法學驗證

3.1.1 專屬性試驗 在上述檢測條件和血漿樣品處理方法下，犬血漿中內源性物質不干擾生物樣品的出峰，基線噪音小，見圖1。

圖1 Beagle犬血漿樣品中補骨脂酚典型色譜圖

3.1.2 標準曲線、定量下限 共進行了3分析批的空白犬血漿標準曲線，其平均線性回歸方程如下：Y= 0.6871X-0.5295（r=0.9992）。利用本法測得犬血漿中補骨脂酚的最低定量限為1.737 ng/mL（S/N＞10）。

3.1.3 精密度與準確度 低、中、高三個濃度樣品的日內、日間精密度與準確度結果見表1，符合藥代動力學研究要求。

表1 精密度與準確度（，n = 7）

表1 精密度與準確度（，n = 7）

時間濃度/ng·mL-1 RSD/% 準確度/%加入量 檢測得量日間3.474 3.032 ± 0.046 1.53 87.28 23.16 22.391 ± 0.833 3.72 96.68 46.32 46.376 ± 1.540 3.32 100.12日內3.474 3.304 ± 0.198 5.98 95.12 23.16 22.646 ± 0.908 4.01 97.78 46.32 45.699 ± 1.627 3.56 98.66

3.1.4 提取回收率 HPLC分析測試結果見表2，表明補骨脂酚在血漿中提取回收率穩定，符合藥代動力學研究要求。

表2 提取回收率（n = 5）

3.1.5 樣品穩定性 犬血漿樣品穩定性結果見表3，血漿樣品在不同條件下的準確度在之間，精密度小于，符合藥代動力學測定要求，表明犬血漿樣品在不同條件下放置穩定。

表3 穩定性（n = 3）

4 討論

4.1 紫外檢測波長的選擇 以甲醇為溶劑，對補骨脂酚進行紫外掃描，發現其在260nm處有最大吸收，所以將檢測波長定為260nm。

4.2 色譜條件的選擇 本試驗考察了不同洗脫系統及是否加酸對生物樣品中補骨脂酚色譜行為的影響。比較了補骨脂酚在甲醇-水系統和乙腈-水系統下的分離狀況，發現補骨脂酚在這兩種系統下都能得到很好的分析，無背景噪音干擾，但因甲醇-水系統較為經濟實惠，故本試驗選擇了甲醇-水作為洗脫系統。結果見圖1。

補骨脂酚結構中含有酚羥基，顯弱酸性，在洗脫系統加入一定量的酸，將有助于色譜行為的改善。本試驗選擇了0.2%冰醋酸作為修飾劑，色譜峰峰形得到明顯改善。

4.3 血漿樣品的制備 生物樣品數量較多，故建立一種簡便、經濟、快速的處理方法非常有必要。本試驗采用乙酸乙酯液液萃取法處理血漿樣品。預試驗結果發現蛋白沉淀法也能使分析物有高的回收率（90%），但是其背景噪音較大，滿足不了本試驗檢測限的要求。

內標化合物的引入對減少生物樣品分析的誤差，保證分析的準確非常重要。本試驗也考察了不同內標化合物（丹參酮ⅡA、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚）對分析的影響，結果所考察化合物因在本試驗色譜條件下的保留時間不合適，內源性物質對所選內標化合物的干擾或理化性質不適宜而被啟用，最終本試驗未采用內標定量，直接用補骨脂酚以外標法進行分析。

4.4 隔室模型擬和及結果 用藥動學程序對表4所列數據進行處理，計算相關參數。本文根據AIC、F檢驗共同來判斷房室模型。判斷方法為對于同一權重，當檢驗無顯著性差異時，選擇房室數小者，當F有顯著性差異時，選擇AIC小者。結果補骨脂酚緩釋片血藥濃度擬合符合二室模型。

4.5 補骨脂酚Beagle 犬體內的藥代動力學 Beagle犬給予補骨脂酚緩釋片后，所測得的補骨脂酚的平均血藥濃度-時間曲線見圖2，從圖可以看出自制補骨脂酚緩釋片在犬體內表現為較好的緩釋，不同時間點犬體內補骨脂酚的濃度見表4。以二室模型計算所得的各個藥代參數見表5。

表4 不同時間點比格犬血漿中補骨脂酚的濃度（n = 5）

表5 藥代動力學參數

圖2 Beagle犬口服補骨脂酚緩釋片后的補骨脂酚的血藥濃度-時間曲線（n = 5)

5 小結

本試驗建立了補骨脂酚在犬體內血漿藥物濃度的HPLC檢測方法，犬血漿中的內源性物質不干擾補骨脂酚的測定，線性關系良好，補骨脂酚的最低定量限為1.737ng/mL，回收率大于85%，高、中、低劑量組日內、日間差均小于6%，穩定性試驗結果表明，補骨脂酚血漿樣品在室溫放置4h、8h，-20℃下凍存24h，-20℃下凍融3次，20℃下自動進樣器樣品盤中放置24h是穩定性。方法學研究結果表明，所建立的方法符合生物樣品的測定要求。該方法被成功用于測定犬灌胃給藥后24h體內補骨脂酚犬血漿中不同時間的移行濃度。

研究結果表明灌胃給予Beagle犬10mg/kg補骨脂酚部位后在4.6h后達到峰濃度，且補骨脂酚濃度在服用后2～18h內能較好地維持平穩的血藥濃度，表明補骨脂酚在犬體內緩慢吸收。本研究為補骨脂酚相關制劑的臨床前藥動學研究提供了試驗基礎。