益母草堿調控成纖*維細胞內EGF蛋白表達及對乳腺癌細胞增殖的影響

★ 肖亮 楊軍平 黎秋如 王瑩*（.江西中醫藥大學附屬醫院檢驗科 南昌 330006；.樟樹市中醫醫院檢驗科 江西 宜春 3300）

據流行病學研究表明，乳腺癌已成為女性患病率最高的惡性腫瘤之一。最近幾年來，乳腺腫瘤相關的基質成纖維細胞介導乳腺腫瘤的發生、轉移及潛在治療靶點已成為基礎研究的新熱點。腫瘤微環境中，乳腺基質成纖維細胞可被轉化和激活成腫瘤相關成纖維細胞［1-2］，隨后分泌大量活性因子維持乳腺腫瘤微環境的內部狀態、調控乳腺腫瘤的發生［3］、發展及遷徙［4-5］。而在乳腺腫瘤微環境內，表皮生長因子（EGF）早已被證實與基質成纖維細胞轉化為腫瘤相關成纖維細胞密切相關［6-7］。

中醫藥學從古至今，在治療和預防乳腺疾病包括乳腺腫瘤等方面都具有非常重要的作用［8-9］，現代醫學也證實益母草對乳腺癌具有抑制功效［10-11］。

本研究通過建立成纖維細胞（ESF-1）與乳腺癌細胞（BT474）體外共培養模型，益母草堿（leonurine）干預后，觀察ESF-1細胞內表皮生長因子（EGF）的表達及對BT474細胞增殖的影響，希望為益母草的臨床應用提供科學依據，也為乳腺腫瘤的臨床治療與基礎研究開拓新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本實驗為細胞生物學體外實驗，人乳腺導管癌細胞株（BT474）購買于中科院（上海）生命科學研究院細胞中心（No.TCHu143）；人表皮成纖維細胞（ESF-1）購買于中科院（北京）基礎醫學研究所細胞中心（No.3111C0001-CCC000108）；實驗于2017年1月—2018年5月于江西中醫藥大學附屬醫院實驗室內完成。

1.2 儀器與試劑 Transwell共培養小室（0.4um）購自于Fisher Scientific公司；快速總RNA提取試劑盒套裝購自于Generay公司；逆轉錄試劑盒Fast Quant RT Kit（with gDNase）購自于TIANGEN公司；qPCR試劑IQ SYBR Green Supermix購自Bio-Rad公司；DMEM-H培養基購自于GIBCO公司；EGF引物購自于上海吉瑪生物公司；Human EGF ELISA Kit購自于R&D Systems公司；cck-8試劑盒購自于日本同仁公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞共培養 利用通透性佳的Transwell小室，將ESF-1細胞和BT474細胞分別均勻接種于小室的上下兩面，因培養液的相互流動從而達到細胞共培養的目的。見圖1。

圖1 細胞共培養

1.3.2 實驗分組及益母草堿藥物干預 取處于對數生長期 ESF-1細胞接種于下室、BT474細胞接種于上室；實驗分組為ESF-1組，ESF-1/BT474共培養組，ESF-1/BT474藥物干預組（ESF-1/BT474+leonurine）；待接種細胞貼壁后，藥物干預組加入益母草堿濃度為10umol/孔，藥物濃度參考于相關文獻［12］及前期基礎實驗。

1.3.3 ESF-1細胞中表皮生長因子（EGF）表達的檢測 各實驗組細胞共培養或單獨培養24h、48h后，利用qRT-PCR方法測定ESF-1細胞中EGF mRNA的水平。EGF引物為：上游5' CAA AAC GCCGAAG ACT TACC 3'；下游 5' GAC CAT CCA GAG CCA GACAC 3'；共培養或單獨培養48h、72h后，利用ELISA方法測定細胞培養液中EGF的蛋白濃度。

1.3.4 CCK-8法檢測BT474細胞增殖 取處于對數生長期的ESF-1細胞及BT474細胞分別接種在Transwell小室的上下面，實驗分組為BT474組、BT474藥物干預組（BT474+leonurine）、ESF-1/BT474共培養組、ESF-1/BT474藥物干預組（ESF-1/BT474+leonurine），均勻鋪呈，每孔約2×105個/mL，培養或共培養24h、48h、72h后，CCK-8法檢測BT474細胞增殖。

1.4 統計學處理 利用SPSS Statistics 17.0軟件統計包進行實驗數據處，利用均數±標準差表示實驗結果；利用t檢驗及多重方差分析兩組別之間的差異，P＞0.05為無顯著差異，P＜0.05為顯著差異；PCR數據采用 Bio-Rad CFX Manager軟件分析。

2 結果

2.1 ESF-1細胞內EGF的表達水平

2.1.1 各實驗組ESF-1細胞內EGF mRNA的表達水平 各實驗組培養或共培養24h、48h后，利用qRT-PCR檢測ESF-1細胞內表皮生長因子（EGF）mRNA的相對表達水平。見表1。相對于ESF-1實驗組，ESF-1/BT474共培養組中ESF-1細胞內EGF 的mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）；而相對于ESF-1/BT474共培養組ESF-1/BT474藥物干預組（ESF-1/BT474+leonurine）中，ESF-1細胞內EGF的mRNA的表達水平明顯下降，具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 24h、48h后各實驗組EGF mRNA相對表達水平（2-ΔΔCt）

2.1.2 各實驗組細胞培養液內EGF蛋白的表達 單獨培養或共培養48h、72h后，利用ELISA方法檢測各實驗組細胞培養液內表皮生長因子（EGF）的濃度水平（表2）。相對于ESF-1組，ESF-1/BT474共培養組細胞培養液內表皮生長因子（EGF）濃度表達顯著升高（P＜0.05）；而相對于ESF-1/BT474共培養組ESF-1/BT474藥物干預組（ESF-1/BT474+leonurine）中細胞培養液內表皮生長因子（EGF）濃度明顯下降，具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 48h、72h后各組培養液內EGF濃度

2.2 益母草堿對乳腺癌BT474細胞增殖的影響單獨培養或共培養24h、48h、72h后，利用CCK-8法測定各實驗組中BT474細胞的增殖情況。見表3。單獨培養或共培養24h，各實驗組BT474細胞增殖情況未見顯著差別（P＞0.05）；培養或共培養48h后，相較于BT474組，各實驗組BT474細胞增殖情況也無顯著差別（P＞0.05），但相較于BT474藥物干預組（BT474+leonurine），ESF-1/BT474組內BT474細胞增殖加快，具有統計學（P＜0.05）；培養或共培養72h后，相較于BT474組，BT474藥物干預組（BT474+leonurine）內BT474細胞增殖減少有明顯差別（P＜0.05）；相較于ESF-1/BT474組，ESF-1/BT474藥物干預組（ESF-1/BT474+leonurine）內BT474細胞增殖減少有明顯差別（P＜0.05）。

表3 各組BT474細胞增殖情況（OD值）

3 討論

益母草在臨床上應用廣泛，相關研究早已證實益母草對乳腺癌具有抑制功效［10-11］，其主要藥效物質益母草堿具有多種生物學功能，可通過下調腫瘤壞死因子TNF-α、誘導型一氧化氮合酶iNOS的表達并且上調核轉錄因子NF-κB、細胞外信號調節激酶ERK的表達，從而對乳腺炎發揮明顯的抗炎作用［13］；益母草堿還能通過調控ROS的水平及NF-κB、MMP-2、TNF-α的表達發揮減少急性腎損傷［14］、抗細胞纖維化［15］、抗炎癥［16］等多種生物學功能。

表皮生長因子（EGF）是一種單鏈多肽，含有53個氨基殘基，能通過結合EGF受體啟動一系列的信號傳遞從而調控細胞的增殖、分化、凋亡等生物學功能，并且與腫瘤細胞的發生、發展密切相關［17］。

本實驗利用細胞共培養技術，探討與乳腺腫瘤細胞共培養環境中，成纖維細胞內表皮生長因子（EGF）的變化及益母草堿干預的效果。實驗結果提示，與ESF-1細胞單獨培養相比，ESF-1/BT474共培養組成纖維細胞ESF-1內EGF的mRNA、蛋白水平表達均升高，實驗結果說明，與乳腺腫瘤細胞共培養能上調成纖維細胞內EGF蛋白的表達；另與ESF-1/BT474共培養組比較，ESF-1/BT474藥物干預組（ESF-1/BT474+leonurine）中ESF-1細胞內mRNA、蛋白表達明顯減少，說明益母草堿能有效抑制共培養環境中成纖維細胞ESF-1內EGF的表達。

本實驗還通過CCK-8法測定了各研究組中乳腺腫瘤BT474細胞的增殖情況。單獨培養或共培養24h后，各實驗組BT474細胞增殖情況未見明顯差別，可能因為時間過短，乳腺癌BT474細胞還大都未進入對數增殖期；培養或共培養72h后，相較于BT474組，BT474藥物干預組（BT474+leonurine）內BT474細胞增殖減慢（P＜0.05），說明益母草堿能有效抑制乳腺癌BT474細胞的增殖；培養或共培養48h后，相較于BT474藥物干預組（BT474+leonurine），BT474組內BT474細胞增殖無明顯差別（P＞0.05），，可能益母草堿藥物作用還未完全顯現，但與之相比，ESF-1/BT474組中BT474細胞增殖有明顯差別（P＜0.05），說明與益母草堿能夠抑制乳腺癌BT474細胞的增殖不同，EGF可能與乳腺癌BT474細胞的增殖具有正相關性。

4 結論

綜上結果，本次實驗通過利用細胞共培養模型，研究乳腺癌細胞與成纖維細胞的相互影響及益母草堿的干預效果。實驗結果顯示與乳腺腫瘤細胞共培養，能上調成纖維細胞內EGF的表達，同時與乳腺腫瘤細胞的增殖可能具有正相關性；且實驗結果還顯示，益母草堿能下調成纖維細胞內EGF的表達并抑制乳腺腫瘤細胞的增殖。這為本實驗團隊研究共培養環境中，益母草堿調控成纖維細胞的轉化提供了非常有力的支持，也為益母草在乳腺腫瘤的臨床治療上提供新的參考和理論依據。