蛹蟲草、山楂提取物固體飲料制備工藝研究

劉春宇，朱振元，孫會輕，王淮旭，張立娟

（食品營養與安全國家重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又名北冬蟲夏草，與冬蟲夏草同屬異種是一種名貴的中草藥[1]。蛹蟲草含有蟲草多糖、蟲草素、核苷類、甾醇類等營養成分和人體必需的氨基酸、維生素和過氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等多種生物活性物質[2]。多糖是蛹蟲草提取物的重要活性成分之一，研究表明，蛹蟲草多糖具有免疫調節作用、抗癌作用、抗氧化作用、降血糖功能、對肝炎的治療作用以及對酒精所致肝損傷的保護作用等生物活性功能[3-5]。目前蛹蟲草產品開發主要集中在蟲草酒制品、膠囊保健品、蛹蟲草保健醬油等方面，但關于便攜式功能食品尤其是速溶性固體飲料功能食品的開發較少。因此本文用蛹蟲草提取物復配山楂提取物制備固體飲料，不僅提高固體飲料的營養價值，同時開拓了蛹蟲草新產品加工新途徑，具有廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草子實體：天津東方中濱農業科技有限公司；山楂：市售一級；木糖醇購：安徽豐原發酵技術工程研究有限公司；檸檬酸：北京北方霞光食品添加劑有限公司。以上原料均為食品級。

1.2 材料與設備

ESJ205-4電子天平：沈陽龍騰電子標量儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機：美國Thermo公司；LD4-40型低速大容量離心機：北京醫用離心機廠；SP-2102UV型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3 蛹蟲草提取物的制備

1.3.1 工藝流程

蛹蟲草子實體→粉碎、過篩→提取→離心→濃縮→醇沉→離心→凍干→蛹蟲草提取物

1.3.2 試驗步驟

將干燥的蛹蟲草子實體用粉碎機粉碎，過80目篩，精確稱取一定質量的蛹蟲草粉末，按固液比1∶10（g/mL）比例加入蒸餾水，在80℃水浴條件下提取2 h，在4 000 r/mim條件下離心10 min，收集上清液，固體沉淀重復提取2次，合并上清液；將蛹蟲草提取液進行旋蒸、濃縮；以1∶4（濃縮液∶無水乙醇，體積比）的比例向濃縮液中加入無水乙醇，對濃縮液進行醇沉處理；醇沉24 h后，將醇沉體系在4 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，收集所得沉淀，沉淀用真空冷凍干燥機進行凍干，得到淡黃色無味粉末，為蛹蟲草提取物，記錄蛹蟲草提取物的質量計算其得率，并用于后續試驗。

1.4 山楂提取物的制備

1.4.1 工藝流程

山楂→清洗→烘干→去核→粉碎、過篩→提取→離心→濃縮→醇沉→離心→凍干→山楂提取物

1.4.2 試驗步驟

將山楂清洗、去核后烘干，用粉碎機粉碎，過80目篩，精確稱取一定質量的山楂粉末，參考1.3.2步驟對山楂粉末進行提取，凍干后得到淺黃色粉末，為山楂提取物，記錄山楂提取物的質量計算其得率，并用于后續試驗。

1.5 蛹蟲草提取物、山楂提取物有效成分含量的測定

分別精確稱取蛹蟲草提取物、山楂提取物5 mg，加入少量蒸餾水溶解，定容至5 mL，得到濃度為1 mg/mL的蛹蟲草提取物溶液和山楂提取物溶液，分別對其總糖、還原糖、蛋白質及黃酮含量進行測定。

1.5.1 總糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[6]分別測定蛹蟲草提取物、山楂提取物中可溶性總糖含量。

1.5.2 還原糖含量的測定

采用 3，5-二硝基水楊酸 （3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[7]分別測定蛹蟲草提取物、山楂提取物中還原糖含量。

1.5.3 蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍（G-250）法[8]分別測定蛹蟲草提取物、山楂提取物中可溶性蛋白質含量。

1.5.4 黃酮含量的測定

采用蘆丁比色法[9]分別測定蛹蟲草提取物、山楂提取物中黃酮含量。

1.6 蛹蟲草山楂固體飲料的評定標準

參照GB/T 17321-2012《感官分析方法二-三點檢驗》[10]和GB/T 21172-2007《感官分析食品顏色評價的總則和檢驗方法》[11]中感官分析標準，制定《蛹蟲草、山楂提取物固體飲料的評定標準》。將沖泡好的固體飲料，由10名（5男5女）感官評價人員對其進行感官評分，每次評分前用溫開水漱口。評定標準如表1所示，按照如下標準，分為4個等級，分別對其評分。綜合感官評價分值＝20%×外觀形態評分＋20%×色澤評分＋20%×風味評分＋40%×口感評分[12]。

表1 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料的評定標準Table 1 The evaluation criteria of Cordyceps militaris extract and hawthorn extract solid beverages

1.7 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料單因素試驗

1.7.1 蛹蟲草提取物添加量對飲料感官評分的影響

蛹蟲草提取物添加量分別為 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g，山楂提取物添加量為2.0 g，檸檬酸添加量為0.08 g，木糖醇添加量為2.0 g，將復配好的樣品溶于100 mL熱水中，對飲料進行感官評價，每組試驗重復3次。以感官評分為指標，確定蛹蟲草提取物的最適添加量。

1.7.2 山楂提取物添加量對飲料感官評分的影響

山楂提取物添加量分別為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g，蛹蟲草提取物添加量為0.5 g，檸檬酸添加量為0.08 g，木糖醇添加量為2.0 g。參照1.7.1步驟，確定山楂提取物的最適添加量。

1.7.3 木糖醇添加量對飲料感官評分的影響

木糖醇添加量分別為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g，蛹蟲草提取物添加量為0.5 g，山楂提取物添加量為2.0 g，檸檬酸添加量為0.08 g。參照1.7.1步驟，確定木糖醇的最適添加量。

1.7.4 檸檬酸添加量對飲料感官評分的影響

檸檬酸添加量分別為 0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 g，蛹蟲草提取物添加量為0.5 g，山楂提取物添加量為2.0 g，木糖醇添加量為2.0 g。參照1.7.1步驟，確定檸檬酸的最適添加量。

1.8 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料正交試驗設計

為使蛹蟲草、山楂提取物固體飲料口感達到最佳，在單因素試驗基礎上，進行L9（34）正交試驗，以感官評價為指標，得出蛹蟲草、山楂提取物固體飲料的最佳配方，正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設計Table 2 Design of orthogonal experiment factors and levels

1.9 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料理化性質的測定

1.9.1 固體飲料粉潤濕性的測定

稱取0.500 g樣品均勻平鋪于200 mL蒸餾水水面上，記錄樣品從加入至完全沉降所需要的時間（s）。

1.9.2 固體飲料分散性的測定

稱取5.000 g樣品加入50 mL蒸餾水，在恒溫磁力攪拌器上攪拌，記錄從攪拌開始到粉塊全部分散所需要的時間（s）。

1.9.3 固體飲料粉溶解度的測定

精確稱量樣品5.000 g，置于50 mL小燒杯中，加入蒸餾水30 mL，在25℃條件下用磁力攪拌器攪拌30 min，使蛹蟲草、山楂提取物固體飲料充分溶解。將溶液轉移至容量瓶中，并用蒸餾水定容至50 mL，充分搖勻。取15 mL溶解液，放入離心管中，3 000 r/mim離心10 min，取上清液，將其全部轉移至干燥的稱量皿中，放入105℃干燥箱中烘干至質量恒定[13]。

式中：X為樣品溶解度，g/100 g；M為樣品質量，g；m1為稱量皿質量，g；m2為稱量皿和不溶物干燥后質量，g；B為樣品水分含量，%。

1.10 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料感官、理化和微生物指標檢驗

水分含量測定，參照GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中的直接干燥法；鉛（以Pb計）測定，參照GB 5009.12-2017《食品安全國家標準食品中鉛的測定》；總砷（以As計）測定，參照GB 5009.11-2014《食品安全國家標準食品中總砷及無機砷的測定》；菌落總數測定，參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》；大腸菌群測定，參照GB 4789.3-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》；霉菌和酵母菌測定，參照GB 4789.15-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》；致病菌限量測定，參照GB 29921-2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》。

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草提取物、山楂提取物得率

蛹蟲草子實體粉末與山楂粉末經水提醇沉、真空冷凍干燥后得到蛹蟲草提取物及山楂提取物。經計算，蛹蟲草提取物及山楂提取物的得率分別為6.72%和23.79%。

2.2 蛹蟲草提取物、山楂提取物有效成分含量

2.2.1 標準曲線

參照1.5中方法，測定總糖含量和還原糖含量的葡萄糖標準曲線回歸方程分別為y=0.010 1x+0.022 9（R2=0.999 2）和 y=0.001 1x-0.031 3（R2=0.999 2）；測定蛋白質含量的牛血清蛋白標準曲回歸方程為y=0.005 7x+0.006 5（R2=0.999 1）；測定黃酮含量的蘆丁標準曲線回歸方程為y=2.107x-0.083 7（R2=0.999 0）。綜上所述，各標準曲線的回歸方程具有良好的線性關系，可用于指標的測定。

2.2.2 有效成分含量

蛹蟲草提取物和山楂提取物中有效成分測定，結果如表3所示。

表3 蛹蟲草提取物、山楂提取物有效成分含量Table 3 The active ingredient contents of Cordyceps militaris extract and hawthorn extract%

由表3可得，蛹蟲草提取物和山楂提取物的主要成分均為糖類物質，其中多糖類物質的含量分別為37.63%和35.70%；據報道，山楂多糖具有抗氧化[14]、抗疲勞[15]、降血壓[16]、降血脂[17]等作用；蛹蟲草多糖具有抗氧化、降血糖、保肝、抗腫瘤等生物活性。其次為蛋白類物質；除此之外還含有少量黃酮類物質。

2.3 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料單因素試驗

2.3.1 蛹蟲草提取物添加量對飲料感官評分的影響

蛹蟲草提取物添加量對飲料感官評分的影響如圖1所示。

圖1 蛹蟲草提取物添加量對產品感官評分的影響Fig.1 Influence of Adding Amount of Extract from Cordyceps militaris on Sensory Score

由圖1可知，飲料的感官評分隨蛹蟲草提取物添加量的增加呈先增長后降低的趨勢，在蛹蟲草提取物添加量為0.5 g時達到最大（93.9±1.9），且與其他組具有極顯著差異。因此，蛹蟲草提取物的最適添加量為0.5 g。

2.3.2 山楂提取物添加量對飲料感官評分的影響

山楂提取物添加量對飲料感官評分的影響如圖2所示。

由圖2可知，飲料的感官評分隨山楂提取物添加量的增加呈先增長后降低的趨勢，在山楂提取物添加量為2.0 g時達到最大（91.9±1.5），且與其他組具有極顯著差異。山楂提取物溶于水后味道偏酸，會對飲料的味道產生顯著影響。因此，山楂提取物的最適添加量為2.0 g。

圖2 山楂提取物添加量對產品感官評分的影響Fig.2 Influence of adding amount of extract from hawthorn on sensory score

2.3.3 木糖醇添加量對飲料感官評分的影響

木糖醇添加量對飲料感官評分的影響如圖3所示。

圖3 木糖醇添加量對產品感官評分的影響Fig.3 Influence of adding amount of xylitol on sensory score

由圖3可知，在木糖醇添加量為1.0 g～2.0 g范圍內，飲料的感官評分呈上升的趨勢；在木糖醇添加量為2.0 g和2.5 g時，感官評分沒有差異；在木糖醇添加量為3.0 g時感官評分顯著下降。木糖醇可以增加飲料的甜度，但過量的木糖醇會使飲料甜度過大，影響產品的口味。因此，木糖醇的最適添加量為2.0 g。

2.3.4 檸檬酸添加量對飲料感官評分的影響

檸檬酸添加量對飲料感官評分的影響如圖4所示。

由圖4可知，當檸檬酸添加量在0.06 g和0.08 g時，飲料的感官評分沒有顯著差異，但極顯著優于其他組。適量的檸檬酸可以調節產品的酸味，但過量添加會使產品的酸度過大，影響其口感。因此，檸檬酸的最適添加量為0.06 g。

2.4 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料正交試驗

圖4 檸檬酸添加量對產品感官評分的影響Fig.4 Influence of adding amount of citric acid on sensory score

由單因素試驗結果得出，蛹蟲草提取物添加量、山楂提取物添加量、木糖醇添加量、檸檬酸添加量均對飲料的感官評分有顯著影響，因此在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，以感官評價為指標，對蛹蟲草提取物添加量、山楂提取物添加量、木糖醇添加量、檸檬酸添加量四因素進行L9（34）正交試驗，優化蛹蟲草、山楂提取物固體飲料的最佳配方。利用SPSS18.0對試驗結果進行分析，正交試驗結果直觀分析結果和方差分析結果分別如表4和表5所示。

表4 正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experimental

表5 正交實驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experimental

由表4和表5可以看出，4個因素對飲料的感官評分都有顯著的影響，主次順序為A（蛹蟲草提取物添加量）＞D（檸檬酸添加量）＞B（山楂提取物添加量）＞C（木糖醇添加量），最小的是木糖醇的添加量。得到飲料的最佳配比為A2B2C2D1，即蛹蟲草提取物0.5 g、山楂提取物2.0 g、木糖醇2.0 g、檸檬酸0.05 g。按以上條件進行驗證試驗，得出感官評分的平均值為95.42，高于表4中的試驗結果，因此，蛹蟲草、山楂提取物固體飲料的最佳配比為：蛹蟲草提取物0.5 g、山楂提取物2.0 g、木糖醇 2.0 g、檸檬酸 0.05 g。

2.5 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料理化性質

經測定，蛹蟲草、山楂提取物固體飲料潤濕性為63 s，分散性為46 s，溶解度為98.35%。樣品溶于水后，潤濕和分散時間較短，溶解度越較大，說明該固體飲料的溶解性越好。

該固體飲料顆粒均勻、細膩，水分含量低，且未添加任何添加劑；在沖泡后，能均勻的溶于熱水中，不結塊、不沉淀，說明產品具有良好的流動性、分散性及穩定性。

2.6 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料感官、理化和微生物指標

2.6.1 感官指標

蛹蟲草、山楂提取物固體飲料為紅棕色、均勻一致的固體，該配方沖調于100 mL熱水，溶解性好；口感圓潤、酸甜適度，蛹蟲草山楂混合香氣濃郁。

2.6.2 理化指標

經測試，蛹蟲草、山楂提取物固體飲料水分含量≤5%；總砷含量（以 As計）≤0.5 mg/kg；鉛（Pb）含量≤1.0 mg/kg，理化指標符合GB/T 29602-2013《固體飲料》標準。

2.6.3 微生物指標

經測試，蛹蟲草、山楂提取物固體飲料菌落總數≤1 000 CFU/g；大腸菌群≤40 MPN/100 g；霉菌和酵母菌≤50 CFU/g；致病菌未檢出，微生物指標符合國家標準。

3 結論

本試驗采用水提醇沉法得到蛹蟲草提取物和山楂提取物，兩種提取物中主要含有多糖、蛋白質、黃酮等活性成分，因此以蛹蟲草提取物、山楂提取物為主要原料進行蛹蟲草、山楂提取物固體飲料制備工藝研究。通過單因素、正交試驗得到最佳配方為蛹蟲草提取物添加量0.5 g、山楂提取物添加量2.0 g、木糖醇添加量2.0 g、檸檬酸添加量0.05 g。將此配方溶于100 mL熱水中，得到溶解性、分散性、流動性、穩定性良好，營養豐富，酸甜可口，具有蛹蟲草獨特風味，便于攜帶的固體飲料。適合各類人群，是具有開發前景的一種功能飲品。