酶解黃秋葵籽蛋白制備抗氧化肽的工藝優化

郭溆，田碩，程安瑋，王新坤，王青，劉超，孫金月，*

（1.山東省農業科學院農產品研究所/山東省農產品精深加工技術重點實驗室/農業部新食品資源加工重點實驗室，山東濟南250100；2.濟南市畜產品質量安全監測中心，山東濟南250000）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus L.）為錦葵科（Malvaceae）秋葵屬（Abelmoschus Medic）一年生草本植物。黃秋葵種子近球形，種皮呈灰黑色至褐色，有小腺體，揉之有咖啡香味，干粒約重55 g～75 g。目前黃秋葵種子主要用于油脂的提取，隨之會產生大量的餅粕。黃秋葵種子蛋白質含量豐富約占20%，脫脂后可達55%[1]，蛋白質營養價值與大豆蛋白接近[2]。隨著人們生活水平的不斷提高，對植物蛋白的需求量也越來越大，植物蛋白不僅可作為食品添加劑，也可作為營養成分補充人體所需的蛋白質。蛋白質由于其分子量大且結構復雜，攝入人體后不易被消化吸收，從而影響了其生理功能和營養價值的有效發揮。

近年來，多肽在生物體內所發揮的生理功能受到越來越多的重視。多肽與蛋白質相比，具有結構簡單分子量小的特點，多肽不僅能為機體提供營養，還具有調節植物神經系統、活化細胞免疫機能、改善心血管功能、抗衰老等多種生理活性功能[3]。氧化與人類的癌癥、老化、動脈硬化等多種疾病相關，適當攝入具有抗氧化活性的物質可以降低體內自由基水平，防止脂質過氧化，幫助機體抵御疾病，對于預防和治療心血管、糖尿病、癌癥、衰老等慢性病有一定的療效。1960年Marcuse首次報道了多肽具有抗氧化活性[4]，此后對食源性抗氧化肽的活性研究引起廣泛關注，并發現許多來自食物蛋白的寡肽或多肽具有抗氧化活性[5-8]。因此，通過蛋白質的可控酶解技術制備天然的抗氧化肽，研究開發多肽類抗氧化食品、保健品具有十分重要的科學意義和應用前景。

目前利用制備的黃秋葵籽粕蛋白開發活性肽的研究還鮮見報道，個別有關黃秋葵籽蛋白酶解工藝的優化多以提高水解度為目標[9]。由于水解度與抗氧化能力之間并不是單純的線性關系[10]，根據蛋白水解度制備的抗氧化肽的活性還不是很高。該研究將利用制備的黃秋葵籽粕蛋白為原料，探究應用響應面法（response surface method，RSM）優化制備抗氧化活性肽的最佳酶解條件，獲得利用黃秋葵籽粕蛋白制備具有較強抗氧化活性多肽的最佳工藝，為黃秋葵籽粕的精深加工開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃秋葵籽收獲于山東省農業科學院農產品研究所章丘龍山試驗基地。將黃秋葵籽干燥后粉碎，使用石油醚作為溶劑，采用索氏提取裝置去除黃秋葵籽中的油脂，獲得的籽粕低溫烘干后備用。

復合蛋白酶（1.5AU-A/g）、堿性蛋白酶（2.4AU-A/g）、中性蛋白酶（0.8AU-A/g）、風味蛋白酶（500LAPU/g）：諾維信公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）、1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀，石油醚：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

AR423CN型電子天平：美國奧豪斯公司；Allegra 25R型高速冷凍離心機：美國Beckman公司；LXJ-IIB離心機：上海安亭科學儀器廠；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏公司；FE20K型臺式酸度計：美國梅特勒-托利多公司；907型超低溫冰箱：美國賽默飛世爾公司；Lab-1A-50E型真空冷凍干燥機：北京博醫康公司；UV-1800型紫外分光光度計：日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 黃秋葵籽粕蛋白的制備

稱取黃秋葵籽粕置于燒杯中，按1∶10（g/mL）的料液比加入去離子水，用1 mol/L NaOH溶液調整pH值到11.0，180 W超聲2.5 h提取蛋白，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，用1 mol/L鹽酸調pH值至3.80，離心收集沉淀，沉淀置于-60℃真空冷凍干燥機中凍干，-20℃儲存備用。

1.2.2 最適蛋白酶的篩選

稱取5等份黃秋葵籽粕蛋白溶于去離子水中，分別加入不同的蛋白酶（加酶量6.25%，底物濃度2%），在各自最適溫度和pH值條件下（詳見表1），酶解8 h。然后將反應液置于沸水中10 min滅酶活，離心取上清液，分別測定水解度和DPPH自由基清除率，篩選出最適合黃秋葵籽粕蛋白酶解的蛋白酶。

表1 5種蛋白酶的最適酶解條件Table 1 Optimal reaction conditions of five proteases

1.2.3 多肽制備的單因素試驗

選用篩選出的最適蛋白酶，設定底物濃度、加酶量（[E]/[S]）、酶解時間、酶解溫度、酶解pH值5個單因素進行試驗。在進行單因素試驗時，除被考察單因素外，其它4個因素均設定為相同的固定值。采用水解度和DPPH自由基清除率為響應值，研究各種單因素對制備多肽的抗氧化活性的影響。

1.2.4 響應面優化試驗

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，選取加酶量（A）、酶解時間（B）、底物濃度（C）、酶解溫度（D）作為自變量進行組合，以DPPH自由基清除率為響應值，確定最佳制備工藝，并進行試驗驗證。

1.2.5 黃秋葵籽粕蛋白酶解效果指標的測定

1.2.5.1 酶解物水解度的測定

待測樣品酶解過程中，通過不斷滴加0.5 mol/L NaOH溶液使混合液pH值保持不變，并記錄一定時間間隔的堿液消耗量，用于計算黃秋葵籽粕蛋白的水解度。水解度（degrees of hydrolysis，DH）的計算采用pH-state法[11]，該方法的原理是根據水解過程中釋放質子的量對水解度進行測定。其計算公式為：

式中：C為NaOH溶液濃度，mol/L；V為NaOH溶液消耗體積，mL；m為樣品蛋白質質量，g；h為每克黃秋葵籽粕蛋白原料中肽鍵的毫摩爾數（h=7.84 mmol/g）；T為試驗溫度，K；α為氨基的平均離解度；pKa為α-氨基的解離度的負對數。

1.2.5.2 酶解物對DPPH自由基清除率的測定

分別配制133.3 mg/L的待測樣品溶液和0.1mmol/L的DPPH溶液。取1 mL待測樣品液加入1 mL DPPH溶液，混勻后室溫避光反應30 min，在517 nm波長下測定吸光度值Ai。向1 mL去離子水中加入1 mL待測樣品溶劑，作為空白組記錄吸光度為Aj。向1 mL去離子水中加入1 mL DPPH溶劑，作為對照組記錄吸光度為A0[12-14]。使用無水乙醇調零，計算公式為：

1.2.6 數據統計分析

采用SPSS Statistics 17.0軟件對數據進行顯著性分析，結果以平均值±標準差表示。P＜0.05表示差異顯著有統計學意義，P＜0.01說明差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 水解蛋白酶的篩選

通過水解度和DPPH自由基清除力兩個指標對水解蛋白酶進行篩選，結果表明5種蛋白酶水解得到的酶解產物的水解度和DPPH自由基清除力均不同，見圖1。

圖1 不同蛋白酶酶解對黃秋褲籽粕多肽水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effects of proteases on hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate of peptides prepared from okra seed meal protein

由圖1A可以看出，5種酶的水解反應都符合酶反應動力學曲線變化規律，在酶反應的最初1 h內水解度隨著時間的延長而逐漸增加，1 h后水解反應逐漸趨于平穩，5種酶的水解速度從高到低依次是：堿性蛋白酶＞復合蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞風味蛋白酶；由圖1B可以看出，堿性蛋白酶酶解后得到的多肽對DPPH自由基的清除能力較強。因此，綜合考慮水解度和水解產物的抗氧化能力，后續研究將選用堿性蛋白酶對黃秋葵籽粕蛋白進行酶解。

2.2 單因素試驗分析

2.2.1 底物濃度對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響

固定加酶量6%、酶解時間8 h、酶解溫度50℃，在pH 8.0的條件下，測定不同底物濃度對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響，見圖2。

圖2 底物濃度對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effects of substance concentrations on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

結果表明，隨著底物濃度的增加，DPPH自由基清除率呈現出先增加后降低的趨勢，在底物濃度數為0.75%時達到最大值49.3%，隨后開始降低。根據試驗結果變化趨勢，選擇0.5%、0.75%、1.0%3個水平進行響應面優化。

2.2.2 加酶量對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響

固定底物濃度3%、酶解時間8 h、酶解溫度50℃，在pH值為8.0的條件下，研究不同加酶量對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響，見圖3。

圖3 加酶量對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effects of enzyme dosage on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

結果表明，DPPH自由基清除率隨著加酶量的增加呈先升后降的趨勢，在2%時DPPH自由基清除率最低，僅為24.71%，在6%時清除率最高，達到47.39%，隨后隨著加酶量的不斷增加清除率呈逐漸降低的趨勢。根據試驗結果變化趨勢，選擇4%、6%、8%3個水平進行響應面優化。

2.2.3 酶解時間對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響

固定底物濃度3%、加酶量6%、酶解溫度50℃，在pH值為8.0的條件下，研究不同酶解時間對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響，見圖4。

圖4 酶解時間對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effects of hydrolysis time on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

結果表明，2.5 h～4 h之間隨著時間的增加DPPH自由基清除率呈現緩慢增加趨勢，在4 h時DPPH自由基清除率達到最高（48.35%），隨后隨著時間的增加DPPH自由基清除率逐漸降低。根據試驗結果變化趨勢，選擇3.5、4、4.5 h 3個水平進行響應面優化。

2.2.4 酶解溫度對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響

固定底物濃度3%、加酶量6%、酶解時間8 h，在pH值為8.0的條件下，研究不同酶解溫度對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響，見圖5。

圖5 酶解溫度對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of temperature on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

結果表明，DPPH自由基清除率在5℃時達到最大（47.59%），之后隨著時間的增加，逐漸降低。根據試驗結果變化趨勢，選擇45、50、55℃3個水平進行響應面優化。

2.2.5 pH值對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響

固定底物濃度3%、加酶量6%、酶解時間8 h、酶解溫度50℃的條件下，研究不同pH值對黃秋葵籽粕抗氧化肽制備的影響，見圖6。

圖6 pH值對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effects of pH value on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

結果表明，隨著pH值的升高，DPPH自由基清除率呈先升高后降低的趨勢，在pH值為8時達到最大值，結果與堿性蛋白酶的最適pH值相吻合。因此，后續試驗制備活性肽時選用的最適酶解pH值為8.0，而不選擇pH值作為響應面分析的因素。

2.3 響應曲面法優化黃秋葵籽粕抗氧化肽制備工藝

2.3.1 響應面分析結果

在單因素試驗的基礎上，確定了相應的三水平（見表2）并進行響應面分析，以確定黃秋葵籽粕抗氧化肽的最優制備方法，結果見表3。

表2 響應面優化實驗的自變量因素及水平設計Table 2 Independent variables and their levels used in response surface design

表3 響應面法試驗設計及結果Table 3 Response surface experimental design and results

續表3 響應面法試驗設計及結果Continue table 3 Response surface experimental design and results

通過Design-Expert 8.0軟件對各因素進行回歸擬合，根據表2得到以下多元二次回歸方程：

DPPH自由基清除率Y/%=+50.88-1.38A-0.30B-2.22C+0.84D-0.86AB+0.50AC+0.52AD+1.31BC+1.64BD+1.70CD-3.67A2-1.74B2-2.89C2-8.66D2。

對黃秋葵籽粕抗氧化肽的制備工藝進行響應面分析，結果表明（表3）該模型差異顯著（P值＜0.000 1），具有統計學意義。失擬項不顯著（P值=0.293 5＞0.05），說明試驗誤差小。模型的決定系數R2=0.953 6，響應值（DPPH自由基清除率）與變量（底物濃度、加酶量、酶解時間和酶解溫度）之間具有很好的線性關系，校正決定系數R2（adj）=0.907 2＞0.80，說明總黃酮提取率的變化有90.72%來自于所選的變量。

方差分析結果表明（表4），模型的自變量二次項BD、CD、B2均達顯著水平（P＜0.05）；一次項 A、C，二次項 A2、C2、D2均呈極顯著水平（P＜0.01）。根據 F 值的大小順序推斷變量對響應值的影響程度依次為：底物濃度（C）＞加酶量（A）＞酶解溫度（D）＞酶解時間（B）。

表4 二次回歸模型的方差分析結果Table 4 Analysis of variance for quadric regression model

續表4 二次回歸模型的方差分析結果Continue table 4 Analysis of variance for quadric regression model

2.3.2 因素間的交互影響

通過回歸方程得到三維響應曲面圖及相應的二維等高線圖，根據其可直觀地看出4個變量對響應值的影響，并確定最佳工藝條件的范圍，見圖7。

圖7 任意兩變量交互作用對DPPH自由基清除率影響的響應曲面圖Fig.7 Response surface plots for the synergetic effects of any two variables on DPPH radical scavenging activity

結果表明，加酶量和底物濃度對酶解產物DPPH自由基清除率的影響最為顯著，表現為曲面較陡；其次是酶解溫度；酶解時間對總酶解產物DPPH自由基清除率的影響最小，表現為曲面較為平緩。加酶量和酶解溫度、酶解時間和酶解溫度以及底物濃度和酶解溫度的相互作用較為顯著，表現為等高線呈現橢圓形；其它因素的相互作用不顯著，表現為等高線呈圓形。

2.3.3 最佳酶解條件的預測及試驗驗證

通過對二次多項式數學模型進行解析，得出酶解蛋白的最佳工藝條件為：加酶量5.8%、酶解時間3.81 h、底物濃度0.68%、酶解溫度49.88℃、pH 8.0。該條件下，黃秋葵籽蛋白酶解產物對DPPH自由基清除率的預測值為51.54%。為檢驗該方法的可靠性，根據實際的操作條件，將黃秋葵籽蛋白酶解的最佳條件修正為：加酶量6%、酶解時間3.8 h、底物濃度0.7%、酶解溫度50℃、pH 8.0。修正條件下，實際測得黃秋葵籽蛋白酶解產物對DPPH自由基清除率為50.83%，與預測值相比偏差為1.38%，證實了模型的有效性。

3 結論

選用5種蛋白酶對黃秋葵籽粕蛋白進行酶解，以蛋白水解度和DPPH自由基清除率為指標，篩選確定堿性蛋白酶為水解黃秋葵籽粕蛋白的最佳蛋白酶。在單因素試驗結果的基礎上，以DPPH自由基清除率為響應值，采用響應曲面法對黃秋葵籽粕蛋白制備抗氧化肽的工藝條件進行優化，建立了二次多項式數學模型，具有良好的顯著性。試驗結果表明，加酶量和底物濃度對酶解產物DPPH自由基清除率的影響最為顯著。利用黃秋葵籽粕蛋白制備抗氧化肽的最佳條件為：加酶量6%、酶解時間3.8 h、底物濃度0.7%、酶解溫度50℃、pH 8.0，該條件下通過試驗獲得的DPPH自由基清除率為50.83%，與模型預測值相近，充分驗證了該模型的可靠性。該研究利用黃秋葵籽粕蛋白作為原料開展制備抗氧化肽的研究，旨在提高黃秋葵種子及其籽粕的利用率，為黃秋葵種子及其籽粕的精深加工與開發利用奠定了理論技術基礎，并且具有較強的實際應用價值。