高鹽稀態發酵黑豆醬油工業化研究

（天津市利民調料有限公司，天津300308）

黑豆，又稱烏豆，是大豆的一種，是我國傳統的醫食兩用食品，是植物中營養比較豐富的保健佳品。黑豆營養豐富，具有高蛋白、低熱量的特性，每百克含蛋白質36.1 g、脂肪15.9 g、膳食纖維10.2 g、碳水化合物23.3 g、鈣 224 mg、鎂 243 mg、鉀 1 377 mg、磷 500 mg，還含有人體必需的VB1、VB2、VC、煙酸和微量元素鐵、錳、鋅、銅、鉬、硒等，其中蛋白質含量高的可達48%以上，居豆類之首，素有“植物蛋白之王”的美譽[1-2]。黑豆蛋白質中的氨基酸組成結構也優于黃豆，不僅含有人體必需的8種必需氨基酸，其比例也符合人體需要，特別是黑豆中的賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸含量與黃豆相比，分別高出 15.5%、15.3%、29%[3-4]。

但是，黑豆在利用方面存在一些弊端。直接食用黑豆有很重的苦澀味，抗營養因子未失活，也不能達到保健的功效。關于黑豆醬油深加工的研究多停留在實驗室階段，很少實現了產業化生產。因此，本論文研究高鹽稀態發酵黑豆醬油產業化的可行性，依托公司現有黃豆醬油生產線，進行黑豆醬油發酵嘗試。在米曲霉、酵母菌等微生物的作用下，能將黑豆的保健作用充分發揮，制作出高品質醬油。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豆：市售青仁黑豆，黑龍江產區；福林酚（BR）：北京華邁科生物技術有限責任公司；三氯乙酸（分析純）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純）、酪氨酸（食品級）：南京化學試劑股份有限公司；甲醛（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；醬油曲精：濟寧玉園科技有限公司；硝酸銀（分析純）：天津市南開化工廠；鉻酸鉀（分析純）：天津市天大化工實驗廠；硫酸（分析純）：天津化學試劑三廠；硼酸（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司。

SP-752型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；PHSJ-5型實驗室pH計：上海精密科學儀器有限公司；SY201S-1型電熱恒溫干燥箱：天津市三水科學儀器有限公司；SKD-2000型全自動凱氏定氮儀：上海市沛歐分析儀器有限公司；DN3800型玻璃鋼保溫發酵罐：連云港中復連眾復合材料有限公司；SZG型蒸球：江陰市華信藥化設備有限公司；SFY-25-50-100L三聯發酵罐：鎮江生物設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 指標測定

成曲中性蛋白酶活力測定：SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測定法》中福林法；成曲糖化酶活力測定：GB 1886.174-2016《食品安全國家標準食品添加劑食品工業用酶制劑》中A.3方法；水分測定：GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中直接干燥法；鹽分、總酸測定：GB/T 5009.40-2003《醬衛生標準的分析方法》；可溶性無鹽固形物、總氮、氨基酸態氮、銨鹽測定：GB/T 18186-2000《釀造醬油》；還原糖測定：GB 5009.7-2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》中直接滴定法。

1.2.2 制曲過程檢測

黃豆醬油中黃豆與炒小麥的質量比為7∶3，考慮到黑豆蛋白含量偏高，將黑豆與炒小麥質量比調整為6∶4。兩組試驗泡發、蒸煮、接菌量、制曲控制保持一致。黃豆（黑豆）在泡豆槽加入足量水，經8 h～12 h泡發。泡豆完全的標準：表面無褶皺，掰開無白心。

泡好的黃豆（黑豆）進入蒸球中蒸煮。蒸煮條件為：0.2 MPa，2 min。正好的條件為：豆子的碾碎壓力為5 000 N～6 000 N。

冷卻后，豆子與炒小麥混合，接種種曲0.3‰。品溫超32℃第一次翻曲，10小時后第二次翻曲，72小時后出曲。

取36、72h的曲料樣品，進行中性蛋白酶活力測定。

1.2.3 發酵過程檢測

成曲和19°Be'鹽水（0℃～5℃）混合入罐發酵，鹽水用量為曲料3倍。發酵過程中間歇攪拌，品溫28℃時，加入酵母培養液（≥107cfu/mL），每罐35 L。定期從灌底出油口取樣檢測鹽分、總酸、氨基酸態氮、可溶固形物、銨鹽等指標。當樣品氨基酸態氮含量≥1 g/100 mL時，醬油成熟。

2 結果與分析

2.1 成曲質量分析

制曲的目的在于使米曲霉充分的生長繁殖，為醬油發酵分泌積累高活力豐富的酶系。在這些酶中，蛋白酶是最為重要的一種。蛋白酶將豆類中的蛋白質降解為多肽和小分子的氨基酸等可溶性含氮物質。該過程反應越徹底，醬油中的蛋白質、氨基酸含量就越高，原料蛋白質的利用率也就越高[5-6]。

糖化酶將淀粉質原料分解為可利用的葡萄糖，為酵母菌、乳酸菌等微生物提供碳源，是酒精發酵、乳酸發酵的基礎物質，對醬油的色香味有重大影響[7]。

在制曲24、48、72 h分別取樣，對比試驗組和對照組的中性蛋白酶和糖化酶活力。試驗結果見圖1、圖2。

圖1 試驗組和對照組中性蛋白酶活力比較Fig.1 The comparison of neutral protease activity between experimental and control group

圖2 試驗組和對照組糖化酶活力比較Fig.2 The comparison of glucoamylase activity between experimental and control group

從圖1、圖2中可以看出，兩組曲料隨著制曲時間的延長，中性蛋白酶活力和糖化酶活力逐步增長。48小時后，試驗組酶活增長幅度開始明顯高于對照組。這說明，利用黑豆制曲可以得到較高的中性蛋白酶和糖化酶活力。

2.2 發酵過程檢測

2.2.1 總酸含量的檢測

在醬油發酵過程中，乳酸菌利用碳源產乳酸，酵母菌發酵產生一些琥珀酸。醬油中的有機酸起到調和口感的作用[8]，在發酵后期也可作為原料進行酯化反應。因此，總酸是醬油發酵過程中很重要的一個理化指標。每10天取樣一次，結果如圖3。

從圖3中可以看出，兩組樣品的總酸總體上逐步增長。發酵后期，試驗組總酸要略高于對照組。

圖3 試驗組和對照組總酸含量比較Fig.3 The comparison of total acid content between experimental and control group

2.2.2 氨基酸態氮含量的檢測

醬油中氨基酸態氮含量與氨基酸含量成正比，因此是醬油品質好壞的重要指標，也是醬油分級的標準[9]。兩組試驗氨基酸態氮含量變化如圖4。

圖4 試驗組和對照組氨基酸態氮含量比較Fig.4 The comparison of amino acid nitrogen contents between experimental and control group

發酵初期，原料中大分子的蛋白質被分解。所以，初期氨基酸態氮含量升高較快。發酵中后期，氨基酸態氮增長變緩，趨于穩定。但從圖4中可以看出，發酵成熟時，試驗組的氨基酸態氮含量要高于對照組。

2.2.3 還原糖含量的檢測

醬油中的糖不僅是微生物代謝的底物，又可以為美拉德反應提供還原糖。因此，還原糖是影響醬油風味和色澤的重要因素。試驗組和對照組還原糖含量比較如圖5。

圖5 試驗組和對照組還原糖含量比較Fig.5 The comparison of reducing sugar content between experimental and control group

由圖5可知，發酵初期，淀粉類原料在淀粉酶的作用下被分解，造成還原糖含量急速升高。當品溫到達28℃，加入酵母液后，還原糖會被酵母菌利用[10]，所以，造成了還原糖的大幅度下降。在整個發酵過程中，試驗組和對照組的還原糖變化趨勢相似，含量相差不大。

2.2.4 全氮含量的檢測

全氮包括未分解的蛋白質、多肽等可溶性含氮化合物。全氮代表著醬油發酵的完全程度。試驗組和對照全氮含量比較如圖6。

圖6 試驗組和對照全氮含量比較Fig.6 The comparison of total nitrogen content between experimental and control group

由圖6可知，發酵初期，在蛋白酶等酶的作用下，全氮含量急速升高。隨著酵母菌的加入和其他微生物代謝活力增強，全氮含量趨于穩定。雖然試驗組和對照組全氮含量變化趨勢相同，但發酵成熟時，試驗組的全氮含量要高于對照組。

2.2.5 可溶性無鹽固形物含量的檢測

可溶性無鹽固形物主要包括醬油中糖類、有機酸類、氨基酸等。在不添加添加劑的情況下，可溶性無鹽固形物含量越高，說明醬油的品質越高[11]。結果如圖7。

圖7 試驗組和對照無鹽固形物含量比較Fig.7 The comparison of salt free solids content between experimental and control group

由圖7可知，發酵前期，大分子原料被分解成可溶性小分子物質，導致無鹽固形物含量升高。隨著微生物的代謝水平升高，無鹽固形物含量呈現波動狀態。但試驗組的無鹽固形物要高于對照組。

2.3 成品理化對比

發酵成熟后，將試驗組和對照組分別進行壓榨、過濾、滅菌、沉淀。并對最終醬油成品進行理化指標的比對，結果見表1。

表1 成品主要指標對比Table 1 The comparison of main indexes of the end products g/100 mL

從表1中可以看出，在評價醬油品質最重要的3個指標中，試驗組均高于對照組。

3 結論

該文分別以黑豆、黃豆為原料，通過高鹽稀態方式進行醬油的制作，并對兩者的制曲質量、發酵過程中主要理化指標以及成品醬油主要理化指標進行了對比。結果表明：制曲72 h，黑豆曲料的中性蛋白酶活力和糖化酶活力均高于黃豆曲料；發酵過程中各項理化指標總體變化趨勢相似，并呈現交替變化。發酵到達終點時，黑豆醬醪的總酸、氨基態氮、全氮、無鹽固形物等指標均高于黃豆醬油，還原糖低于黃豆醬油；成品黑豆醬油的可溶無鹽固形物、氨基酸態氮、總氮指標均高于黃豆醬油。