新疆地區四種草莓病毒病原的檢測

楊波，趙寶龍，郝小軍，都業娟，何旺

(1.特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室/石河子大學農學院，新疆石河子 832000；2.新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用自治區普通高校重點實驗室/石河子大學農學院，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】草莓是薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)植物，其果實具有較高的營養及保健價值。草莓也已成為我國乃至世界廣泛栽培的重要經濟作物。截止到2015年，我國草莓栽培面積達12.93×104hm2，總產量達347.9×104t，種植面積和產量均居世界第一位[1]。新疆草莓栽培自20世紀30年代，草莓生產取得較大發展，南北疆各地區均有種植[2]。草莓為多年生常綠草本，主要靠匍匐莖進行無性繁殖，在長期無性分株過程中，很容易感染病毒并在植株內積累，造成草莓品種植株矮化，匍匐莖減少，結果能力減弱，果實品質變差，產量下降等種性退化。草莓一旦感染病毒，多是代代相傳，病毒病可造成草莓減產30%～80%[3]。因此，調查與檢測新疆草莓主栽區病毒病發生情況，對推進新疆草莓無病毒種苗的生產和應用具有實際意義。【前人研究進展】目前，世界上已報道的草莓病毒病多達 25 種，主要有草莓斑駁病毒病(strawberrymottlevirus，SMoV)、草莓鑲脈病毒病(Strawberryveinbandingvirus，SVBV)、草莓輕型黃邊病毒病(Strawberrymildyellowedgevirus，SMYEV)、草莓皺縮病毒病(Strawberrycrinklevirus，SCV)等[4,5]。我國于20世紀80年代末開始對草莓部分病毒進行調查和鑒定。鄭巧兮、王國平等[6-9]分別通過電鏡觀察和嫁接指示植物方法，對上海、遼寧、山東、河北、陜西、甘肅各地草莓進行調查鑒定，主要有草莓斑駁病毒(strawberrymottlevirus，SMoV)、草莓輕型黃邊病毒(Strawberrymildyellowedgevirus，SMYEV)、草莓鑲脈病毒(Strawberryveinbandingvirus，SVBV)和草莓皺縮病毒(Strawberrycrinklevirus，SCV)四種病毒，帶毒率最高達99%，并且多以復合感染為主。高慶玉等[10]對黑龍江省草莓病毒病種類進行研究，發現四種病毒也多以復合感染形式存在。韋石泉、吳元華等[11,12]對遼寧遼陽、沈陽、興城、朝陽，吉林長春、四平、通化、大連、丹東、黑龍江哈爾濱、河北保定、江蘇南京及湖北武漢草莓斑駁病毒以及草莓鑲脈病毒調查發現，SMoV和SVBV的單獨感染率也分別在90%和20%以上。王運生等[13]對北京、浙江、四川、河北等不同地區草莓進行初步調查及RT-PCR檢測，SVBV、SMoV、SCV、SMYEV在不同品種間均有發生，并且SVBV發生最為普遍。【本研究切入點】調查檢測范圍有限，僅僅局限我國內地部分省市地區。近年來，隨著新疆設施農業的發展，以草莓為主題的觀光農業也迅速發展，病毒病是影響草莓產業發展的一個重要因素。但關于新疆該地區草莓病毒病發病情況以及病毒種類相關研究未見報道。研究檢測與調查新疆地區四種草莓病毒病原。【擬解決的關鍵問題】利用草莓上4種主要病毒特異性引物，通過RT-PCR對南北疆主栽區的草莓進行檢測，分析不同地區草莓病毒種類以及草莓帶毒情況，為新疆草莓無病毒苗的生產和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

2017年4～5月，從新疆烏魯木齊、伊犁、哈密、庫爾勒、阿克蘇和石河子等草莓主栽區15個采樣地，隨機采取450株草莓樣品，采回的樣品保存-80℃冰箱。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計

根據相關文獻[14,15]設計引物，委托生工生物工程(上海)有限責任公司合成。表1

表1 四對草莓病毒特定引物序列
Table 1 Specific primers sequences of four strawberry viruses

1.2.2 草莓總RNA提取和cDNA合成

應用艾德萊公司RN09-EASYspin 植物RNA快速提取試劑盒(RN0902)提取草莓總RNA。所提RNA通過 0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。采用艾德萊公司PC18-TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(第一鏈反轉錄試劑盒)合成cDNA，步驟參考說明書，將得到的cDNA保存在-20℃冰箱待用。

1.2.3 草莓病毒病單一RT-PCR檢測

反轉錄得到的cDNA作為模板，用含Taq酶的2×TaqPCR Master Mix(艾德萊)進行PCR。PCR反應體系中含2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O補足到20 μL。反應程序如下：(1)B1/B2、Q1/Q2、A1/A2引物對：94℃預變性2 min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸30s，35個循環，72℃終末延伸5 min，4℃保存。(2)X1/X2引物對：94℃預變性5 min；94℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，35個循環，72℃終末延伸5 min，4℃保存。(3)Z1/Z2引物對：94℃預變性2 min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸40s，35個循環，72℃終末延伸5 min，4℃保存。PCR產物通過2%瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.2.4 三種病毒多重PCR體系建立

利用單一RT-PCR檢測獲得同時感染SMoV、SMYEV和SVBV的草莓樣品cDNA為模板，同一體系加入三對引物進行多重PCR。反應采用20 μL體系，以退火溫度和引物濃度為探索條件，退火溫度設5個水平即53、54、55、56和57℃，使用引物(濃度均為 10 mM)按不同用量組合。對單一條件優化時，其他因素都不變。由于SVBV片段與SMoV和SMYEV擴增片段相比較長，多重PCR反應程序延伸時間以SVBV程序為主。經過多重PCR擴增好的產物用2%瓊脂糖凝膠檢測擴增產物。挑選出條帶清晰、條帶指示正確的最優組合為多重PCR反應體系和程序。用其他同時感染草莓斑駁病毒病、草莓輕型黃邊病毒病和草莓鑲脈病毒病的樣品進行單一PCR對比，驗證多重RT-PCR可靠性和實用性。表2

表2 多重RT-PCR擴增3種草莓病毒引物濃度設置
Table 2 Concentration of primers for 3 strawberry viruses amplified by multiplex RT-PCR

病毒Virus濃度設置 Concentration setting (μL)12345SMoV0.350.400.400.350.35SMYEV0.350.400.350.250.40SVBV0.350.350.250.300.30

1.2.5 新疆草莓主栽區病毒病調查

用單一RT-PCR和多重RT-PCR同時檢測草莓斑駁病毒病、草莓輕型黃邊病毒病和草莓鑲脈病毒病，統計并分析新疆草莓主栽區病毒病感染情況。

2 結果與分析

2.1 草莓總RNA的提取和檢測

應用試劑盒提取草莓總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測可以看出28S和18S條帶清晰可見，完整性較好。應用分光光度計測量RNA濃度在 500 ng/μL以上、OD260/OD280在2.0～2.2，所提RNA濃度和純度較高。圖1

2.2 單一RT-PCR檢測草莓病毒病

應用四種病毒的特異性引物對反轉錄的cDNA進行擴增，對PCR產物進行凝膠瓊脂糖電泳，SMoV、SMYEV和SVBV特異性引物擴增結果分別獲得與目的條帶大小(分別為219 bp、547 bp和271 bp)一致的條帶。分別對目的片段進行凝膠回收、測序，測序結果在GenBack中進行相似性比對，序列結果顯示與NCBI上已上傳的的SMoV、SMYEV和SVBV序列相似性分別為96%、93%和95%以上，說明PCR擴增目標片段為相應的病毒基因片段。而用SCV特異性引物對所有樣品進行檢測，未擴增出目的片段，說明采集的樣品中不含有草莓皺縮病毒。圖2

注：1～4: 4個不同草莓樣品

Note： Lane 1-4: Four different strawberry samples

圖1 草莓組培苗葉片總RNA

Fig.1TotalRNAofStrawberrytissueculture

注：M：DL 2 000；N：陰性對照；1：SMoV；2：SVBV；3：SMYEV

Note： Lane M:DL 2,000; Lane N:Negative control; Lane 1:SMoV; Lane 2:SVBV; Lane 3: SMYEV

圖2 草莓三種病毒單一PCR
Fig.2 Simple PCR detection of three strawberry viruses

2.3 多重RT-PCR檢測草莓病毒病檢測體系建立

根據單一RT-PCR的檢測結果，利用現有引物嘗試建立同時檢測三種病毒的多重RT-PCR，主要對多重RT-PCR檢測體系引物退火溫度和引物用量進行優化。其他反應因素不變條件下，對退火溫度(53～57℃)進行篩選，PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。研究表明，隨著退火溫度增加SMYEV和SVBV條帶逐漸清晰；而SMoV隨著退火溫度(53～55℃)的增加條帶逐漸清晰，當溫度超過55℃時，則SMoV條帶逐漸模糊。綜合考慮三種病毒引物擴增結果，研究選擇最適退火溫度為55℃。

同時也對三對引物(SMoV、SMYEV、SVBV)依次加入量進行優化，當分別加入0.35、0.35和0.35 μL時，研究表明，SMYEV和SMoV的條帶較弱(泳道1)；當SVBV不變，SMYEV和SVBV引物各增加0.05 μL結果顯示SMYEV和SVBV條帶都亮，SMoV較弱(泳道2)；增加SMoV的引物量，SMYEV引物量不變并減少SVBV引物量，結果顯示，SMYEV、SVBV和SMoV條帶亮度基本相近(泳道3)；減少SMYEV和SVBV引物量，SMoV和SMYEV條帶都較弱(泳道4)；增加SMYEV并減少SVBV的引物量，SMoV仍然較弱(泳道5)。因此，研究使用多重PCR體系SMoV、SMYEV和SVBV三種引物配比為0.4∶0.35∶0.25。圖3，圖4

注：M：DL 2 000；N：陰性對照；1～5：53、54、55、56和57℃

Note： Lane M:DL 2,000; Lane N:Negative control; Lane 1-5:53, 54, 55, 56 and 57℃

圖3 多重RT-PCR退火溫度優化
Fig.3 Optimization of anneal temperature of the multiplex RT-PCR

注：DL 2 000；N：陰性對照；1～5：不同濃度組合

Note： Lane M:DL 2,000; Lane N:Negative control, Lane 1-5:Different concentration combinations

圖4 多重RT-PCR引物濃度優化
Fig.4 Optimization of primer concentration of the multiplex RT-PCR

2.4 多重RT-PCR檢測

對采集的新疆草莓主栽區樣品進行SoMV、SMYEV和SVBV多重RT-PCR檢測。對多重RT-PCR檢測同時單一RT-PCR檢測，檢測結果進行比較，多重RT-PCR和單一RT-PCR檢測結果一致，說明建立的多重RT-PCR體系快速、特異地檢測3種病毒。圖5

注：M：DL 2 000；1～17：17個草莓樣

Note： Lane M: DL 2,000; Lane 1-17: Seventeen strawberry samples

圖5 17個草莓樣品檢測結果
Fig.5 Test results of 17 strawberry samples

2.5 新疆草莓主栽區草莓病毒病檢測

利用4種病毒病的特異性引物對采自新疆草莓主栽區的 450 份樣品進行檢測，并對結果進行統計分析。南北疆各地區采集的樣品均檢測出含有SMoV、SMYEV和SVBV三種病毒，SCV病毒未檢出，病毒總檢出率為 64.22%，總檢出率達 90% 以上的采集地有安寧渠鎮、鞏留縣以及和靜縣；檢出率較低的十三師各團場和一師各團場，病毒總檢出率也在25%以上。在所有樣品檢測的3種病毒中，SVBV總檢出率最高，為51.78%，檢出率較高的采集地有安寧渠鎮、鞏留縣與和靜縣，檢出率分別為76.67%、76.67%和73.33%；所有采集地均能檢測出SMoV，總檢出率為23.78%，安寧渠鎮、青格達湖鄉、鞏留縣以及和靜縣檢出率均在40%以上；SMYEV總檢出率9.33%只有阿瓦提縣、十三師各團場與一師各團場三個采集地未檢出SMYEV。三種病毒在南北疆分布沒有規律，不同采集地病毒檢出率差異明顯，同一采集地三種病毒檢出率差異較大。表3

表3 各地不同品種病原病毒檢出率
Table 3 Detection rates of various pathogenic viruses in different regions and varieties

采樣地Location樣品數(份)Number of samples各種病毒檢出率Detection rate of various viruses (%)SMoVSMYEVSVBVSCV各地病毒總檢出Total detection rates of viruses (%)安寧渠鎮(河西村)30401076.67093.33十二師各團場3016.676.6660066.67烏魯木齊縣南山3016.673.3346.67063.33青格達湖鄉30401063.33083.33伊寧縣3033.332066.67086.67鞏留縣30503076.67093.33特克斯縣3016.676.6740050霍城縣303013.3360080察布查爾錫伯族自治縣3016.673.3340053.33四師各團場30106.6756.67063.33十三師各團場 306.67023.33026.67和靜縣30402073.33090一師各團場303.33026.67026.67阿瓦提縣3013.33023.33030八師各團場3023.331043.33056.67合計45023.789.3351.78064.22

通過對所有樣品感染三種病毒的復合侵染情況進行統計，檢測結果顯示，感染兩種及兩種以上病毒檢出率為18.45%，其中，SMoV和SVBV復合侵染最為普遍，總檢出率為10.89%；SMYEV與SVBV以及SMoV與SMYEV復合侵染檢測率分別為4.22%和1.56%；同時感染SMoV、SVBV和SMYEV三種病毒的采集地只有安寧渠鎮、伊寧縣、鞏留縣、霍城縣、和靜縣和八師各團場，總檢出率為1.76%。表4

表4 各病原病毒復合侵染率
Table 4 Complex infection rates of various pathogenic viruses

采樣地Location復合侵染率 Complex infection rates(%)SMoV+SMYEVSMoV+ SVBVSMYEV+ SVBVSMoV+SMYEV+ SVBV安寧渠鎮(河西村)3.33203.333.33十二師各團場0103.330烏魯木齊縣南山03.3300青格達湖鄉3.3323.333.330伊寧縣3.3313.33103.33鞏留縣6.6726.6716.676.67特克斯縣06.673.330霍城縣0106.673.33察布查爾錫伯族自治縣03.333.330四師各團場06.673.330十三師各團場03.3300和靜縣3.3323.33103.33一師各團場03.3300阿瓦提縣06.6700八師各團場3.333.330.006.67合計1.5610.894.221.78

3 討 論

草莓在長期無性繁殖過程中，很容易感染病毒，并且感染草莓的病毒大多具有潛隱特點，單一病毒侵染時一般不表現癥狀，只有多種病毒復合侵染時植株葉片才表現花葉、皺縮、褪綠黃化以及植株矮化等典型癥狀[16,17]。因此，田間診斷很難確定病原。

目前，草莓病毒鑒定的方法主要有指示植物小葉嫁接法、電鏡檢測法、血清法檢測法和分子生物學檢測法[18]。分子生物學因其靈敏度高(能檢測到pg甚至fg水平的病毒)、特異性強、快速、簡便等特點，尤其RT-PCR和多重RT-PCR在草莓病毒鑒定方面應用及其廣泛[14-15,19,20]。研究利用RT-PCR和多重PCR方法對新疆草莓主要種植區樣品，發生最普遍以及危害最為嚴重的四種病毒進行檢測，結果顯示，該地區草莓感染多種病毒，4種病毒的檢出率SVBV較多，SMoV次之，SMYEV較少，SCV未檢出。南北疆不同地區樣品帶毒率差異較大，同一地區不同采集地樣品帶毒率也比較明顯，并且發病率較高的地區草莓多為自繁苗，如烏魯木齊安寧渠鎮、伊犁鞏留縣、南疆和靜縣；引進外地脫毒苗的種植區如十三師各團場、阿克蘇第一師各團場、阿瓦提縣等草莓病毒種類較少帶毒率較低。因此，推廣使用脫毒種苗是減少草莓病毒病原最有效的手段。新疆草莓主要栽培品種多從北京、山東等省(市)引進[21,22]，研究對新疆草莓病毒病原的檢測與調查結果，卻和北京、山東等地的調查結果存在差異，內地調查結果多發現SVBV、SMoV、SMYEV以及SCV共同感染草莓，而此次對南北疆15個不同地區采集的草莓樣品進行檢測，并沒有發現SCV[7,9,13]。新疆由于其獨特的地理位置以及草莓病毒病種類與分布的復雜性，在新疆草莓種植區栽培的草莓是否感染其它種類的草莓病毒有待進一步研究。

4 結 論

2017年，新疆草莓主栽區病毒病發生率較高，病毒總檢出率64.22%，其中鑲脈病病毒病檢出率最高，總檢出率為51.78%；斑駁病毒病和輕型黃邊病毒病檢出率分別為23.78%和9.33%。南北疆不同草莓栽培區以及相同栽培區不同采集地樣品病毒檢出率差異較大，無明顯的地域特征。在危害草莓最為嚴重的4種病毒SMoV、SMYEV、SVBV和SCV中，SMoV、SMYEV和SVBV這三種病毒在全疆主栽區均有發生，并且病毒復合侵染率較高。