施用棉稈炭連作棉花根際土壤真菌多樣性與土壤理化性質及黃萎病的相關性

顧美英，徐萬里，張志東，唐光木，劉洪亮，李志強，劉曉偉，蒲勝海，馮雷，張計峰

(1.新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農業科學院土壤肥料與農業節水研究所，烏魯木齊 830091；3.石河子農業科學研究院，石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】新疆棉花連作現象非常普遍，棉花高效、優質生產與黃萎病等土傳病害防治之間的矛盾日益突出[1]。研究表明，土壤微生態失衡是導致土傳病害發生的主要原因[2]，但至今在生產上仍缺乏高效、安全和規模化應用推廣的棉花黃萎病防控技術[3]。秸稈處理是當前農業和環境面臨的巨大挑戰，仍存在利用率低、轉化率低、經濟效益低和環境污染嚴重等問題[4-5]。棉稈就地粉碎還田是目前棉稈利用的主要方式，但棉稈腐解速度緩慢，且帶病菌棉稈長期還田將導致棉田黃萎病加重，棉稈分解產生的化感物質在土壤中積累的自毒效應也進一步加重了連作障礙[6]，這些都影響新疆棉花產業健康可持續發展。【前人研究進展】作物秸稈熱裂解產生的生物質炭，為一種包含固體穩定性炭質和部分可溶性有機物并包含一定量礦質灰分(包括含有H、O、N、和S等元素)的多種組分混合的有機質[7]。穩定的炭質、良好的孔性及高的陽離子交換量是生物炭區別于其他化學肥料和秸稈有機肥的突出特點，具有顯著改善土壤功能和促進土壤生態系統服務的作用[8-10]。近年來，生物炭對土傳病害防控研究的報道也逐漸增多。生物炭能增加土壤微生物多樣性[11-12]，增強有益微生物(拮抗菌、促生菌和腐生菌等)的數量和活性[13]，與病原菌在營養競爭中占優勢，進而增加土壤生態系統的穩定性和抑病性[14]。真菌是土壤微生物的重要組成，直接影響土壤有機質循環、養分轉化、毒物降解和作物病害發生等。陳坤等研究表明，施用生物炭利于真菌的積累[11]。曹輝等[15]在土壤施入0.5%～4%的炭化蘋果枝對真菌類群組成沒有明顯影響。Solaiman等[16]發現生物炭能促進真菌與根系共生以及真菌菌根的生長。同時，生物炭可促進植物根系生長和養分吸收，使植物健康生長，增強植物對病害的抗性[17-18]。此外也有報道稱由于生物炭具有較強吸附性，可吸附根系分泌的自毒物質，且多孔的結構影響病原菌的活動[19-20]，進而減輕土傳病害的發生。【本研究切入點】采用秸稈生物質炭化還田調控土壤微生態環境，預防控制土傳病害蔓延已成為科研工作者關注的新方向。但目前尚未有關于棉稈炭防控棉花黃萎病的研究報道。研究施用棉稈炭連作棉花根際土壤真菌群落多樣性與土壤理化性質及黃萎病病害的關系。【擬解決的關鍵問題】通過2年的定位試驗，研究施用棉稈炭棉花根際土壤真菌多樣性、病原菌數量和土壤理化性狀及棉花黃萎病防控效果的關系，分析棉稈炭對棉花黃萎病的防控效果及對土壤健康的修復作用機理，為研究棉稈炭在棉花生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗在新疆石河子農業科學研究院連作棉田中進行。該試驗田地處44°20'N、86°03'E，屬典型溫帶大陸性氣候。棉花為覆膜滴灌栽培模式，土壤為灌耕灰漠土。土壤基本理化性質為有機碳12.50 g/kg，速效氮28.31 mg/kg，速效磷12.45 mg/kg，速效鉀286.37 mg/kg，pH 8.32，電導率0.20 ms/cm。

棉稈炭由新疆農業科學院土壤肥料與農業節水研究所提供，其基本理化性質為有機碳771.80 g/kg，全氮15.72 g/kg，全磷15.31 g/kg，全鉀25.04 g/kg，pH 10.27，電導率4.38 ms/cm。熱解溫度400～700 ℃，裂解時間1～2 h。將棉稈炭磨碎并通過2 mm篩。試驗設4個處理：NPK：常規化肥+棉稈移除；NPKS：常規化肥+棉稈全量粉碎耕層混勻還田；NPKB1：常規化肥+棉稈移除+常量棉稈炭(施用量22.50 t/hm2，為耕層土質量的1%)；NPKB2：常規化肥+棉稈移除+增量棉稈炭(施用量45.00 t/hm2，為耕層土質量的2 %)。每個處理3次重復，隨機排列。棉花播種前劃分小區，第1年將棉稈炭一次撒勻后人工翻地，在20 cm深度內混勻，第2年不再補施。試驗處理水肥管理相同，基肥為磷酸二銨75 kg/hm2和尿素225 kg/hm2播種前地表撒施翻耕；生育期隨水滴肥7～8次，每次滴水120～180 m3/hm2，每次隨水滴施尿素60～120 kg/hm2。

1.2 方 法

1.2.1 土樣采集

采用5點法采集第2年不同處理棉花根際土壤。根際土壤采用抖土法采集，挖取0～20 cm土層棉花完整根系，并除去根圍附近較大的土壤團塊，輕輕抖下棉花根表面的土壤作為根際土壤。將樣品混勻后分成2份，一份風干過篩后用于測定土壤理化性質，另外一份于-70℃保存，進行DNA提取，采用高通量測序方法對不同處理土壤中真菌的種類和數量進行分析。

1.2.2 土壤真菌群落結構多樣性

采用CTAB方法對樣本的基因組DNA提取、PCR擴增、純化后，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行454-高通量測序。通過Illumina MiSeq平臺，利用ITS1：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ 和ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′ 為引物，進行高通量測序。測序結束后，對原始序列進行數據拆分、PE Reads拼接、Tags過濾和Tags去嵌合體序列后得到最終的有效序列。然后基于有效數據進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析，并將OTU和物種注釋結合，從而得到每個樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結果。再對OTUs進行豐度、多樣性指數等分析，同時對物種注釋在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。

1.2.3 土壤理化性質測定

采集的土壤樣品，自然風干后，按照常規方法進行土壤pH值、電導率和養分的測定[21]。有機質測定采用重鉻酸鉀容量法，速效氮測定采用堿解擴散法，速效磷測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法，速效鉀測定采用醋酸銨浸提-火焰光度法，pH值測定采用電位法，電導率采用水浸提法。

1.2.4 棉花黃萎病病害調查及病原菌數量統計

棉花黃萎病發生的分級標準[22]：

0級：棉株健康，無病葉，生長正常；1級：1/4以下葉片發病，變黃萎蔫，莖部維管束變淡褐色；2級：1/4～1/2以下葉片發病，變黃萎蔫，莖部維管束變淡褐色；3級：1/2～3/4葉片發病，變黃萎蔫，莖部維管束變淡褐色；4級：棉株3/4以上至所有葉片發病，或葉片大部脫落，棉株枯死。

調查結果的統計：根據調查的結果計算各處理的發病率和病情指數。

發病率(Incidence of disease)=(發病總株數/調查總株數)×100%。

病情指數(Disease index)=[(Σ級數×每級的病株數)/(調查總株數×最高級代表值)]×100%。

大麗輪枝菌數量由高通量測序結果獲得。

1.3 數據處理

高通量測序多樣性指數計算公式如下：

(1)

(2)

SACE=

(3)

采用DPS 9.50軟件對所得數據進行分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)、最小顯著差數法(LSD)進行多重比較差異顯著性檢驗(α=0.05)。隨機選取相似度在97%條件下的OTU生成稀釋曲線，并利用軟件Mothur 計算豐富度指數Chao 和ACE，多樣性指數Shannon。利用Excel 和R語言工具對樣品物種組成及相對豐度統計結果繪制柱狀圖和熱圖。

2 結果與分析

2.1 棉稈炭對連作棉花根際土壤真菌多樣性的影響

2.1.1 棉花根際土壤真菌群落的測序結果及多樣性指數

研究表明，棉稈直接還田和炭化后還田對連作棉田土壤真菌群落多樣性有顯著影響。與NPK處理相比，NPKS處理降低了OTU的豐度，降幅為15.63%；炭化還田中NPKB1處理增加了真菌OTU的豐度，而NPKB2處理則顯著降低了46.25%(P<0.05)。棉稈直接還田和炭化還田對土壤真菌數量均有一定的降低作用，其中增量棉稈炭的作用很顯著。與NPK處理相比，真菌Shannon多樣性指數NPKS和NPKB2處理分別顯著降低了11.81%和65.40%，而NPKB1則增加了9.99%。棉稈直接還田和炭化還田均降低了ACE和Chao1指數。NPKS和NPKB2處理ACE指數分別降低了13.75%和28.39%，Chao1指數分別降低了13.99%和31.45%，NPKB1處理兩個指數降幅均不顯著。棉稈直接還田和增量棉稈炭能顯著降低連作棉田土壤真菌多樣性。表1

2.1.2 棉花根際土壤真菌在門水平的相對豐度

在微生物分類門的水平上，各處理土壤真菌群落種類上差異也不大，但不同處理間各物種的相對豐度之間有差異。與NPK處理相比，棉稈直接還田和炭化還田處理降低了土壤中擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)及其他一些地位不明確的真菌群落的數量；NPKS和NPKB1處理降低了子囊菌門(Ascomycota)數量，但NPKB2處理則顯著增多；接合菌門(Zygomycota)真菌則表現出NPKB2下降幅度最大，其次是NPKS，NPKB1則顯著升高。圖1

表1 不同處理連作棉花根際土壤真菌群落多樣性
Table 1 The diversity index of soil fungal communities difference treatments

TreatmentOTUShannon indexACE indexChao1 indexNPK480.00±10.15b4.83±0.05b533.59±12.13a527.11±19.17aNPKS405.00±18.72c4.26±0.13c460.24±15.95b453.36±20.32bNPKB1518.00±12.29a5.31±0.18a532.36±15.88a523.23±17.90aNPKB2258.00±22.61d1.67±0.16d382.09±16.16c361.33±11.49c

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05), 下同

Note： Different letters in the same column indicate significant difference atP< 0.05. The same as below

圖1 不同處理土壤真菌在門水平的高通量相對豐度
Fig.1 High flux relative abundance of rhizosphere soils at phylum level different treatments

2.1.3 棉花根際土壤真菌在屬水平的相對豐度和Heatmap熱圖

在微生物分類屬水平上，不同處理土壤的前13種優勢真菌菌群的豐度(OTU條數豐度大于1.0%)，合計占真菌總量的65.40%～96.45%，包括Penicillium、Tetracladium、Gibberella、Fusarium、Mortierella、Acremonium等及一些未鑒定出屬的真菌類群。在這13種優勢真菌中，Gibberella和Fusarium是常見的病原菌，NPK、NPKS、NPKB1和NPKB2處理Gibberella屬分別占3.16%、2.24%、3.75%和0.58%，Fusarium屬分別占2.88%、2.19%、3.16%和0.49%。而Acremonium屬則產抑菌物質，四個處理分別占1.91%、1.27%、1.45%和2.69%，但沒有增加Penicillium和Cortinarius等益生真菌的數量。圖2

根據4個處理真菌的相對豐度特征，利用R語言繪制熱圖，并按照真菌相似度進行聚類。結果表明，在屬水平上不同處理間差異顯著，NPK處理和NPKB1處理真菌數量較多，有相似的真菌特征，聚為一類；NPKS處理真菌種類和數量其次，NPKB2處理最少，這2個處理真菌特征相似，聚為一類。圖3

圖2 不同處理土壤真菌在屬水平的高通量相對豐度

Fig.2Highfluxrelativeabundanceoffungiindifferenttreatmentsatgenuslevel

圖3 不同處理土壤真菌物種豐度聚類熱
Fig.3 Cluster heat map of species abundance of fungi in different treatments

2.2 棉稈炭對連作棉田根際土壤理化性質影響

研究表明，棉稈炭化還田處理(NPKB)與棉稈直接粉碎還田處理(NPKS)之間土壤理化性質存在顯著差異(P<0.05)。與單施化肥的對照處理(NPK)相比，NPKS處理連作棉田根際土壤有機質和速效鉀含量差異不顯著，速效鉀含量反而呈下降趨勢；而速效氮和速效磷含量顯著升高，增幅分別為35.06%和143.76%；pH值和電導率差異不顯著，但均呈下降趨勢。棉稈炭處理顯著增加了土壤有機質、速效鉀的含量，NPKB1處理分別增加了30.59%和12.88%，NPKB2處理分別增加了85.88%和38.96%；速效氮含量NPKB1處理與NPK處理差異不顯著，但NPKB2處理增幅顯著，增加了59.09%；速效磷含量均呈下降趨勢；pH值略有下降，但差異不明顯。電導率顯著升高，NPKB1處理和NPKB2處理分別升高了29.41%和70.59%。表1，表2

表2 不同棉稈炭化處理下連作棉田根際土壤理化性質變化
Table 2 Effect of cotton biochar on rhizosphere soil physical properties of continuous cropping cotton field

處理Treatment有機質OM(%)速效氮Available N(mg/kg)速效磷Available P(mg/kg)速效鉀Available K(mg/kg)pH電導率EC(ms/cm)NPK1.70±0.04c38.50±1.06c8.73±0.11b242.30±3.52c7.86±0.01a0.17±0.02cNPKS1.81±0.02c52.00±0.70b21.28±0.41a238.71±4.07c7.84±0.01ba0.16±0.02cNPKB12.22±0.04b38.50±0.41c7.14±0.08d273.51±10.04b7.75±0.03b0.22±0.02bNPKB23.16±0.09a61.25±0.28a7.61±0.08c336.70±5.86a7.77±0.03b0.29±0.02a

2.3 棉稈炭對連作棉花土壤中黃萎病病原菌數量和發病率的影響

從高通量測序結果中大麗輪枝菌數量的結果可以看出，與NPK處理相比，在田間條件下，棉稈還田和常量棉稈炭增加了棉田土壤中大麗輪枝菌的數量，而增量棉稈炭病原菌數量則顯著降低了63.83%。

棉花黃萎病發病率和病情指數的調查結果顯示：與棉稈移除處理相比，棉稈還田和常量棉稈炭處理增加了棉花黃萎病的發病率和病情指數，常量棉稈炭的增加幅度更大一些，分別增加了8%和13.3%；而增量棉稈炭處理發病率和病情指數與棉稈移除處理差異不明顯，但病情指數降低了2.2%。說明增量棉稈炭雖然沒有降低棉花黃萎病的發病率，但有緩解病害發病程度的趨勢。圖4

圖4 棉花根際土壤黃萎病病原菌數量、黃萎病發病率和病情指數
Fig.4 The number, disease incidence and disease index of Verticillium dahliae in different treatments

2.4 棉花根際土壤真菌群落多樣性與土壤理化性質、黃萎病病害的相關性

對不同處理棉花根際土壤理化性質和真菌的OTU豐度大于1%的優勢屬進行冗余分析，兩軸累計貢獻率為82.62% 。研究表明，這4個處理中NPKB2分布于第1象限，NPKB1處理分布于第2象限，NPK處理和NPKS處理分布于第3象限，相距較近，說明施用棉稈炭對棉花根際土壤真菌群落組成有較大的影響。排列檢驗顯示土壤理化性質中的AN和OM對棉花根際土壤真菌群落結構的影響最顯著。圖5

研究表明，秸稈直接還田和炭化后還田，根際土壤真菌多樣性與理化性質和黃萎病發病之間關系密切。真菌的OTU、多樣性指數與AN呈極顯著負相關，與EC呈顯著負相關；Shannon指數、Chao1 index與OM、Shannon指數與AK之間呈極顯著負相關，OTU、ACE index與OM、OTU、ACE index、Chao1 index與AK呈顯著負相關。黃萎病病情指數與OTU、Shannon指數呈顯著正相關。黃萎病病原菌Verticillium數量與黃萎病發病率和病情指數呈極顯著正相關。表3

圖5 不同處理土壤真菌群落和土壤理化性質冗余
Fig.5 Redundancy analysis of fungal communities and soil physical and chemical properties in different treatments

表3 土壤真菌多樣性與土壤理化性質及黃萎病病害相關系數
Table 3 Correlation coefficients between soil fungi diversity and soil physicochemical properties，Verticillium wilt

OMANAPAKpHECIncidence of diseaseDisease indexOTU-0.77?-0.97??-0.05-0.74?0.17-0.67?0.450.63?Shannon index-0.84??-0.93??0.11-0.82??0.25-0.76?0.480.68?ACE index-0.78?-0.99??-0.13-0.73?0.24-0.66?0.290.48Chao1 index-0.81??-0.99??-0.09-0.76?0.28-0.69?0.290.5Verticillium-0.61?-0.69?0.24-0.63?-0.09-0.560.84??0.95??

3 討 論

土壤微生物多樣性對維持土壤健康和抑制植物病害非常重要[2]。已有研究表明，棉花長期連作能導致土壤微生物群落結構發生改變，各種土傳病害滋生，而其中真菌型病害居多，有必要對連作棉花土壤真菌群落結構的變化進行研究。降低土壤中病原菌的數量，是防控土傳病害的有效手段[23-24]。生物炭具有良好的保水保肥能力，對土壤微生物和植物生長產生了積極的影響，進而影響土壤病原菌生長繁殖以及對植物的侵染能力[17、25-27]。而秸稈還田由于將植株上的病原菌也直接還田，增加了土壤中病原菌的數量[28]。研究高通量測序的結果表明，與棉稈移除和棉稈直接還田相比，添加2%用量的棉稈炭能降低真菌OTU數量和多樣性，這與Wang[29]研究結果一致。施用不同用量棉稈炭對連作棉花土壤中優勢真菌種群子囊菌門和接合菌門數量的影響較大。子囊菌門真菌數量施用常量棉稈炭降低，增量棉稈炭則升高。接合菌門則表現出施用常量棉稈炭數量升高，而增量棉稈炭則降低。閻海濤等研究表明生物炭提高了子囊菌門和擔子菌門的相對豐度，降低了接合菌門的相對豐度[30]。子囊菌門真菌與人類生活密切相關。有的能引起根腐、莖腐、果(穗)腐、枝枯和葉斑等植物病害，有的則可產生抗生素、有機酸、激素、維生素等有益于作物生長[31]。研究表明，施用棉稈炭沒有增加子囊菌門中產抗生素的Penicillium屬數量，但增量棉稈炭的施用降低了Gibberella和Fusarium屬病原菌的數量。接合菌門真菌大多為腐生物，可用于食品發酵及酶和有機酸生產；有些接合菌門真菌與高等植物共生形成菌根；還有少數可以寄生植物、人和動物引起病害[32]。研究表明，棉稈炭能增加接合菌門中被孢霉科的數量，被孢霉科能分解土壤中的糖類和簡單多糖物質是土壤有機質和養分含量豐富的標志[33]。多數研究表明，生物炭能促進菌根真菌生長[34]，但研究顯示施用棉稈炭使產菌根真菌的接合菌門和球囊菌門真菌數量減少，這可能與生物炭使土壤中磷含量降低有關[35]，相關研究還需深入進行。

土壤理化性質與土壤微生物、作物病害關系密切。研究表明，增加土壤有機碳含量，提高養分含量能有效地改善土壤環境，減輕作物病害，增加產量[36]。生物炭一般含碳60%以上，輸入后可增加土壤有機碳含量，且本身含有氮、氧、硫等多種養分元素和無機碳酸鹽成分[16]。同時發達的孔隙結構賦予生物炭較強的吸附能力和較大的離子交換量，進而提高土壤的養分利用率和持水能力，進而對土壤健康和植物生長產生積極的影響[37-38]。研究表明，在棉稈炭施用第2年可顯著增加土壤電導率、有機質、速效鉀和速效氮的含量，更有利于改善土壤結構，提高連作棉花土壤中養分的含量。但速效磷含量呈下降趨勢，可能生物炭中磷含量不高，另外，土壤pH值高可能增加了磷的固定，不利于有效磷的釋放[39]。研究中pH值變化不明顯，但呈下降趨勢，這可能與灰漠土本身偏堿性，鹽基飽和度較高，生物炭中可溶性的K、Ca、Na、Mg 等鹽基離子不能顯著提高灰漠土的鹽基飽和度有關，且土壤的緩沖性能較好進而導致施用生物炭對灰漠土pH 的影響較小[40-41]。目前秸稈直接還田是常用的秸稈處理方式，因秸稈含有豐富的氮、磷、鉀、鈣、鎂和有機等，秸稈直接還田也可以增加土壤養分，本研究NPKS處理除速效磷含量外，其余養分含量均低于棉稈炭處理。

相關性分析表明，真菌多樣性與土壤理化性質關系密切[42]。棉稈炭對環境因子的改變，驅動了土壤真菌群落的生態演替，降低了真菌群落多樣性，同時抑制了土傳病原菌活性，進而降低了病害的侵染率。黃萎病病害的發生與土壤中大麗輪枝菌的數量呈極顯著正相關性，這與劉海洋等[43]的研究結果一致。

但棉花黃萎病的發病程度除取決于根際和土體土壤中的病原菌數量及病原菌遺傳變異程度和微生物區系等影響因素外，病原菌的分布、植株健康狀況、環境因子，如土壤溫度、濕度、養分狀況、耕作制度和栽培管理條件等也與棉花黃萎病的發病程度有著密切的相關性。研究中，雖然施用棉稈炭棉花根際土壤真菌群落多樣性和黃萎病病原菌的數量顯著降低，但與棉稈移除相比黃萎病發病率的降低卻并不明顯，常量棉稈炭的發病率甚至上升，僅增量棉稈炭有降低病情指數的趨勢。與目前農民常采取的棉稈直接粉碎還田方式相比，增量棉稈炭還是有一定的防控效果。同時棉稈炭對棉花黃萎病的防控，還取決于棉稈炭的添加量。大田的環境較復雜，棉稈炭對棉花土壤微生態環境的影響，對植株產生間接效應的研究還需加強。

4 結 論

4.1 與棉稈移除和棉稈直接還田相比，施用棉稈炭連作棉花根際土壤真菌多樣性和理化性質有顯著相關性。增量棉稈炭處理降低了根際土壤真菌多樣性，不同用量棉稈炭對子囊菌門和接合菌門真菌數量的影響較大，但菌根真菌數量降低。常量棉稈炭處理與單施化肥處理有相似的真菌群落特征，增量棉稈炭與棉稈直接還田的真菌群落特征相似。RDA 分析中，土壤理化性質影響著土壤真菌群落結構，尤其是土壤的OM和AN含量是重要環境因素。

4.2 施用棉稈炭降低了棉花黃萎病病原菌數量，與NPK處理相比，增量棉稈炭Verticillium數量顯著降低了63.83%。與NPK處理和NPKS處理相比，NPKB1處理增加了黃萎病病害發病率和病情指數，而NPKB2處理黃萎病病害發病率下降不顯著，病情指數分別降低了2.2%和15.0%。棉稈炭化還田沒有顯著降低棉花黃萎病的發病率，但有緩解病害發病程度的趨勢。