黑色素與生物農藥配伍優化及其對棉田產量的影響

朱靜，張志東，劉曉靜，唐琦勇，王博，顧美英，宋素琴，王瑋，張麗娟

(1.新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農業大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】在生物農藥推廣應用中，光線特別是紫外光對農藥的影響最為突出。光線易促使農藥加速降解，減慢藥效發揮，降低藥效或造成防治效果不穩定。新疆作為強太陽光輻射地區，生物農藥失效速度更快，往往需夜間施藥，或需多次施藥，增加了使用成本[1]。自20世紀80年代以來，越來越多來源于植物和微生物的農藥光保護劑被研究發現[2,3]，這些光保護劑能有效的保護生物農藥的光破壞特別是紫外光的破壞，且多數為生物安全和環境友好性助劑，但其高昂的提取和合成成本，往往優先用于化妝品中[4]，且在使用農藥時，一般需添加農藥的1%以上才會起到較好的效果[5]，提高生物農藥的銷售價格及防治成本，還需要探索更適于生產和推廣的光保護劑。【前人研究進展】天然黑色素(melanin)是一種廣泛存在于動植物和微生物中的非均質類多酚聚合體，是一類高分子量褐色-黑色素的總稱[6]。黑色素在紫外線和可見光波長(150～800 nm)均具有良好的光吸收作用，其清除自由基、抗氧化功能均優于SOD、VE等常規抗氧化產品，是理想的生物農藥光保護劑[7,8]。出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)是工業生產重要生物材料短梗霉多糖(英文名Pullulan)的生產菌株，此前的研究和生產中，發現該菌在發酵后期易代謝出黑色素，其與多糖牢固結合，具有良好的水溶性。【本研究切入點】前期從新疆輻射污染土樣中分離篩選出一株出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)菌株MF1[9]，可產生水溶性黑色素，具有較好的熱、酸堿穩定性，并且對H2O2、NaClO和金屬離子有較好的耐受性。其發酵條件簡單，成本低，易于工業化生產，極具開發應用價值。研究天然黑色素對生物農藥的光保護作用。【擬解決的關鍵問題】將短梗霉發酵的黑色素溶液與生物農藥配伍，用于棉田噴灑。通過裂區試驗研究生物農藥與黑色素對蚜蟲殺蟲率及棉田產量的影響，分析生物農藥與黑色素的最佳濃度配比，為天然黑色素在生物農藥中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗地點

試驗地點為新疆石河子市148團(E 86°16' 24.870"，N 44°46' 05.882")，該區域地處古爾班通古特大沙漠南緣，平均海拔高度450.8 m，屬典型的溫帶大陸性氣候，冬季長而嚴寒，夏季短而炎熱，平均氣溫25.1～26.1℃，無霜期為168～171 d，年降水量為125.0～207.7 mm。試驗小區所在棉田常年種植棉花，連作年限10 a以上。棉田種植采用膜下滴灌，機械化耕作。

1.1.2 菌種及試劑

試驗菌株出芽短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)MF1分離自新疆輻射污染環境土壤，由新疆農業科學院微生物應用研究所提供。

棉花品種為新陸早30號(新疆石河子下野地試驗站繁育)；蘇云金桿菌Bt(廣州多宇多生物科技有限公司)、阿維菌素(河北省農藥化工有限公司)和甲維丙溴磷(山東新勢立生物科技有限公司)。

1.1.3 培養基

種子培養基(MEA 培養基)：麥芽浸粉30 g，大豆蛋白胨3 g，純凈水1 000 mL，pH 自然。

發酵培養基：葡萄糖30 g，酵母浸膏2.02 g，磷酸氫二鉀3.0 g，硫酸銨2.0 g，NaCl 0.5 g，CuSO40.16 mg，純凈水1 000 mL，pH自然。

1.1.4 儀器與設備

PL203 電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SPX-150B 生化培養箱，寧波東南儀器有限公司；HZQ-F160 全溫振蕩培養箱，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；Eppendorf 5424 離心機，德國 Eppendorf 股份公司；UV-2550 紫外分光光度計，日本島津儀器(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

黑色素對生物農藥的保護作用及對棉花產量的影響試驗采用裂區試驗設計[11]，農藥使用與農田生產所用一致，即每667 m2Bt 50 g、阿維菌素10 mL、甲維丙溴磷 25 g，溶于50 kg水中，噴灑。裂區試驗設計以農藥用量為主處理，黑色素使用量為副處理。農藥用量以農田使用量為100%，設A1～A3分別為100%、75%、50%三個梯度；黑色素使用量以每667 m2使用黑色素2.5 g為100%，設B1～B7的0、10%、20%、40%、60%、80%、100%七個濃度梯度。試驗共有21個處理，3個重復，共設63個小區。小區面積5 m×4.6 m，采用隨機設計分布，試驗過程采用人工背負式噴霧器打藥，噴水量為50 kg/667 m2，均勻噴霧，其他管理措施與非試驗棉田基本相同。

1.2.2 黑色素發酵

從新鮮斜面挑取一環菌苔，接種于液體種子培養基試管中，30℃，180 r/min 搖床培養36 h，取2 mL 接種于搖瓶中(500 mL三角瓶裝200 mL種子培養基)，30℃，180 r/min 搖床培養2 d，按5%接種量接種于10 L全自動發酵罐，進行發酵生產。10 L全自動發酵罐發酵條件：發酵培養基裝填量7 L，起始pH 6.2，消泡劑10 mL，通氣量3.5 L/min，30℃，100 r/min，發酵5～7 d。發酵結束后，將發酵液高溫滅菌，離心去除發酵雜質及菌體，上清液放置在4℃冰箱備用[10]。

1.3 數據處理

蚜蟲數量測定：于施藥前1 d和施藥后1、3、5 d，采用對角線5點取樣，每點隨機調查10株棉花，每株調查5片葉的蚜蟲數[12]，分別統計蚜蟲數量。試驗數據用SPSS 18.0統計分析軟件進行Duncan’s分析[13]。

棉花產量測定：待棉花收獲時，每個處理小區采用人工采摘，并進行單收單曬以計算籽棉產量。試驗數據用SPSS 18.0統計分析軟件進行Duncan’s分析。

2 結果與分析

2.1 裂區試驗對蚜蟲數量的影響

將試驗原始數據整理成主區A因素(生物農藥濃度)與裂區B因素(黑色素濃度)施藥前蚜蟲基數和施藥1、3和5 d后蚜蟲數量兩向表，計算生物農藥與黑色素配伍施用后殺蟲百分率。對殺蟲率兩因素裂區試驗進行方差分析。F測驗結果表明：施藥天數間，天數×A的P值都大于0.05，說明三次重復之間以及因素A與三次重復之間的交互作用差異不顯著。A因素、B因素、A×B互作均達到極顯著差異，不同的農藥濃度、黑色素濃度殺蟲效率不同，兩個因素需要合理組合才能獲得最好的殺蟲效果。分別對因素A、因素B進行多重比較并對A×B交互作用進行分析。表1～4，圖1

表1 各小區蚜蟲防治效果
Table 1 Control effect of aphid in each plot

注：表中活蟲頭數為3次重復的平均值，下同

Note： The number of live insects in the table is the average of 3 replicates, the same as the table below.

表2 裂區試驗對蚜蟲數量影響方差
Table 2 Variance analysis of split-plot tests on aphid populations

變異來源Sources of variation自由度dfDegree of freedom平方和SSSquare sum均方S2Mean SquareF值F valuePP value施藥天數 Application days22.7331.3661.5460.260因素A Factor A218.5919.29539.7580.002誤差 Error40.9350.234因素B Factor A6177.62629.60434.3800.000誤差 Error1210.3330.861A×B1240.1033.34215.8300.000誤差 Error245.0670.211

圖1 因素A與因素B對殺蟲率交互作用
Fig.1 The interaction of factor A and factor B on pesticidal rate

研究表明，因素A的三個水平分屬不同子集，其中A2的殺蟲效率最高，均值為95.47%。七個水平分屬5個不同的子集，其中B7的殺蟲率最高，均值97.42%。A3B7組合時達到最高值，即農藥濃度選擇原液濃度的50%，黑色素使用量為100%時，即每667 m2使用Bt 25 g、阿維菌素5 mL、甲維丙溴磷12.5 g，黑色素2.5 g，可實現最大的殺蟲率，均值是97.7%。表3，表4，圖1

表3 主區因素A主效應多重比較
Table 3 Multiple comparison analysis table

of main factor A main effect Duncana,b

注：誤差項為均值方(錯誤)=0.38；a.使用調和均值樣本大小=3.000；b.Alpha=0.05

Note： The error term is the mean square (error) = 0.38； a.Use the harmonic mean sample size = 3.000

表4 裂區因素B主效應多重比較

Table 4 Multiple comparison analysis table of secondary factor B main effect Duncana,b

注：誤差項為均值方(錯誤)=0.428；a.使用調和均值樣本大小=9.000；b.Alpha=0.05

Note： The error term is the mean square (error) = 0.428； a.Use the harmonic mean sample size = 9.000

2.2 裂區試驗對棉花產量的影響

從方差分析中看出主區因素A、A×B的交互作用引起的產量沒有差異性，但裂區因素B之間存在一定的差異性。主區三個處理之間沒有顯著性差異，三個處理下棉花產量由大到小的順序是A3>A2>A1。裂區7個處理之間存在一定的差異性，產量隨著黑色素的使用量增加而提高。A3B7處理的產量最高，即生物農藥濃度選擇原液濃度的50%，黑色素使用量為100%時，即每667 m2使用Bt 25 g、阿維菌素5 mL、甲維丙溴磷12.5 g，黑色素2.5 g棉花產量最高，其結果與蚜蟲最佳防治組合一致，小區平均單產可以達到14.3 kg。表5～8，圖2

表5 各小區棉花產量
Table 5 Cotton production in each plot(kg)

主區Main treatment裂區Secondary treatment重復ⅠRepeatⅠ重復ⅡRepeatⅡ重復ⅢRepeatⅢ平均值MeanA1B18.251111.510.3B210111110.7B310.59.513.511.2B412.21112.511.9B510.5131211.8B613.51412.513.3B7141513.514.2A2B1910.59.79.7B210.511.512.511.5B31012.51311.8B411.512.513.512.5B5151311.2513.1B613.513.51514B715.25141314.1A3B198.759.259B210.5149.511.3B3141210.512.2B412.2513.513.513.1B51412.51413.5B6141412.513.5B715131514.3

表6 裂區試驗對棉花產量影響方差
Table 6 Variance analysis of split-plot tests on cotton production

變異來源Sources of variation自由度dfDegree of freedom平方和SSSquare sum均方S2Mean SquareF值F valueP值P value區組 Plot21.4830.7421.3480.656誤差 Error0.4210.2320.550因素A Factor A23.5241.7621.3200.363誤差 Error45.3411.335因素B Factor B6127.39621.23318.1580.000誤差 Error1214.0321.169A×B128.9990.7500.3840.957誤差 Error2446.9061.954

表7 主區因素A主效應多重比較

Table 7 Multiple comparison analysis table of

注：誤差項為均值方(錯誤)=0.19；a.使用調和均值樣本大小=3.000；b.Alpha=0.05

Note： The error term is the mean square (error) = 0.19； a.Use the harmonic mean sample size = 3.000

表8 裂區因素B主效應多重比較
Table 8 Multiple comparison analysis table of

secondary factor B main effect Duncana,b

注：誤差項為均值方(錯誤)=1.693；a.使用調和均值樣本大小=9.000；b.Alpha=0.05

Note： The error term is the mean square (error) = 1.693； a.Use the harmonic mean sample size = 9.000

圖2 因素A與因素B對產量交互作用
Fig.2 The interaction of factor A and factor B on production

3 討 論

新疆作為我國棉花集中生產區，2016年棉花產量占到全國棉花產量的80%。新疆棉區氣候干燥，降水稀少，日照時間長且強度大，全年日照時數為2 550～3 500 h，日照百分率60%～80%[14]，為新疆棉花優質高產創造了優良的自然條件。但在蟲害發生時，長時間高強度的日照也嚴重破壞了生物農藥的作用。相關研究表明，我區生物農藥蘇云金芽孢桿菌(Bt) 在使用過程中，陽光直射30 min，芽孢死亡率即達50%左右，照射1 h死亡率達80%，其伴胞晶體也隨之變形降效，甚至無效；阿維菌素及棉鈴蟲多角體病毒在陽光照射下也會迅速失效[15,16]。因此，自20世紀80年代以來，光保護劑作為生物農藥的重要助劑之一，尋找高效、安全、經濟的農藥光保護劑一直是生物農藥研究的主要領域之一。

研究中采用的天然黑色素具有極強的抗日光及紫外線照射作用，且具有較強的酸堿、熱穩定性，同時對氧化還原反應不敏感，具有螯合部分重金屬的作用[17]。使用之前只需將發酵液高壓滅菌后，簡單過濾即可與生物農藥直接混合噴灑。與其他光保護劑或黑色素制品相比，價格低廉，操作簡易，環保安全。在大田條件下，研究以生物農藥用量為主處理，黑色素用量為副處理進行裂區試驗。通過試驗優化，當農藥濃度為原液濃度的50%，黑色素濃度為100%時，即每667 m2使用Bt 25 g、阿維菌素5 mL、甲維丙溴磷12.5 g，黑色素2.5 g時，試驗小區平均蚜蟲殺蟲率最佳，可達到97.7%，平均棉花產量達14.3 kg。而相同條件下未使用黑色素的對照試驗小區中，蚜蟲平均殺蟲率僅為92.3%，棉花平均產量10.3 kg。試驗發現，部分小區的殺蟲效率和棉花產量隨著黑色素使用的濃度升高而提高。在研究中生物農藥的使用量卻并非越高越好。無論殺蟲率或棉花產量，均在農藥使用量為常規用量濃度的一半時(50%)效果最佳，這一結果可能是由于單位黑色素對生物農藥的保護作用有限，當農藥濃度過大時，現有濃度的黑色素難以進行保護從而導致農藥效果下降。因此，75%和100%濃度的農藥使用效果反而不佳。

通過對未加黑色素的生物農藥防效的分析發現，在試驗中生物農藥的推薦使用量與使用其一半時的防效幾乎無差別。過量施用、盲目施用農藥和化學肥料，會導致農田土壤健康情況下降，導致植物生長情況變差和病蟲害的多發。研究利用天然黑色素與生物農藥的配伍，不僅可以提高生物農藥的使用效率，減少農藥的施用量，降低生物農藥的使用成本，對維護良好的農業生態環境具有積極的作用。

4 結 論

通過農藥濃度與黑色素濃度裂區試驗對蚜蟲殺蟲率及棉田產量進行研究，當農藥濃度為原液濃度的50%，黑色素濃度為100%時，即每667 m2使用Bt 25 g、阿維菌素5 mL、甲維丙溴磷12.5 g，黑色素2.5 g時，可達到97.7%的最大蚜蟲殺死率，以及均值14.3 kg/小區的最大棉花產量，顯著高于對照小區的試驗結果。研究生物農藥與黑色素的最佳濃度配比，為天然黑色素在生物農藥中的應用提供一定的理論依據。