除濕通痹方對大鼠急性痛風性關節炎模型抗炎作用機制研究

昆明市中醫醫院，云南 昆明 650011

痛風性關節炎是尿酸鈉在關節腔內形成微晶體沉淀后引起的非特異性關節炎癥[1]，以關節的紅、腫、熱、痛為重要表現[2]，甚至出現關節變形，嚴重影響患者生活質量[3]。除濕通痹方是在中醫基礎理論指導下，結合臨床應用總結而來，有較好的抗炎、鎮痛作用。本實驗觀察除濕通痹方對急性痛風性關節炎模型大鼠炎癥程度、IL-1β、IL-1R影響。

1 材料

1.1 動物 清潔級，SD大鼠72只，雌雄各半，購于購于四川省醫學科學院實驗動物研究所。生產許可證號：SCXK(川)2008-24，合格證號：0002777。飼養于云南中醫學院動物房，180～200 g，自由活動、進食。

1.2 藥物 秋水仙堿(規格：50 mg/片，批號：H53021369，西雙版納藥業有限公司)。除濕通痹方由昆明市中醫醫院制劑室提供(由王不留行、萆薢、荊芥、防風、川芎、羌活、元胡、牛膝、茯苓等組成，煎煮濃縮至2 g/mL)。

1.3 試劑 抗IL-1β抗原(西隴化工股份有限公司 33535)；PBS(索萊寶科技有限公司；P1010)；大鼠免疫組化試劑盒(索萊寶科技有限公司；G8590)等。

1.4 儀器 電子分析天平；顯微鏡；DECTA320 pH計；GB2292型套式恒溫器；振蕩混合器；離心機等。

2 方法

2.1 尿酸鈉結晶及尿酸鈉溶液的制備[6]將800 mg尿酸鈉和155 mL生理鹽水混合，加熱尿酸鈉溶解。滴入1 mol/L的鹽酸，調整pH 6.8～7.2。離心至晶體不再析出，置于4℃冰箱保存備用。

2.2 除濕通痹方制備 將王不留行、元胡、牛膝、萆薢、羌活等中藥按劑量比列放置在套式恒溫器中，武火煮沸后改文火煎煮，濃縮藥液至2 g/mL 。

2.3 動物模型的制備 采用 Coderre方法[7]造模。水合氯醛麻醉、消毒，將尿酸鈉溶液 (50 mg/mL)注入踝關節腔，復制急性痛風性關節炎模型。

2.4 分組及給藥 SD大鼠72只，隨機分為6組，分為空白組、模型組[4 mL/(kg·d)]、秋水仙堿組[0.0012 g/(kg·d)]為陽性組,除濕通痹方低劑量組[9 g/(kg·d)]、中劑量組[18 g/(kg·d)]、高劑量組[36 g/(kg·d)]。除空白組外，余5組大鼠復制大鼠急性痛風性關節炎模型。造模后2 h后開始灌胃，連續灌胃7d，處死大鼠取材[8]。

2.5 觀察指標

2.5.1 大鼠關節腫脹度 每只鼠注射尿酸鈉(MSU)晶體溶液前及注射MSU晶體溶液2 h左后足容積。足跖腫脹度為注射MSU前后大鼠左后足容積之差。

2.5.2 關節軟組織內炎癥細胞計數(淋巴細胞、巨噬細胞) 第7d灌胃3 h后麻醉處死大鼠，取左踝關節軟組織。常規甲醛液固定、脫鈣、脫水、透明、浸蠟，包埋，切片4 m，蘇木精一伊紅染色。用Image Pro-Plus 6.0行圖像分析。

2.5.3 關節軟組織內IL-1β、IL-1R 石蠟切片常規脫蠟，過氧化氫去內源性酶，胰酶消化暴露抗原，滴加一抗，4℃孵育過夜，滴加生物素標記二抗、酶標記鏈霉卵白素過氧化物酶，聯苯二胺 (DAB) 顯色。

2.6 統計方法 用Image Pro-Plus 6.0行圖像分析后采用 SPSS 18.0統計軟件進行統計分析，以P<0.05有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠左足跖腫脹度的比較 由表1可知，造模后第3d，與模型組比較，各給藥組差異無統計學意義；造模后第7d，與模型組比較，各給藥組足腫脹度均顯著降低 (P<0.01)；除高劑量組與陽性組比較差異有統計學意義 (P<0.05)。

表1 各組大鼠左足趾腫脹度的比較

2.2 各組大鼠關節軟組織切片中單位面積炎癥細胞計數比較 由表1可知，與空白組比較，其余各組的關節切面中均產生大量淋巴細胞及巨噬細胞(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組差異均有高度統計學意義(P<0.01)；其中淋巴細胞計數陽性組與除高組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 各組大鼠關節軟組織中 IL-β、IL-1R 表達的比較 由表3可知，與空白組比較，模型組、陽性組、除濕通痹方各劑量組的 IL-β、IL-1R平均光密度值均升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組平均光密度值顯著降低(P<0.05)； 陽性組與除中、低組比較差異無統計學意義(P>0.05)，此三組與除高組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠關節軟組織中單位面積炎癥細胞計數比較 (個

表3 各組大鼠IL-1β、IL-1R平均光密度值的比較

4 討論

急性痛風性關節炎屬中醫“痹證”范疇，臟腑失職、脾虛不運；臟腑陽盛積熱，日久成病[9]；急性期當以“通”為治則，通濕、除痰、化瘀，以“通”止痛，“通則不痛”[9]，由此組方為除濕通痹方。方中王不留行消腫止痛；萆薢祛風除痹，川木通通利關節；茯苓、澤瀉泄腎濁；桔梗利五臟，荊芥、防風勝濕止痛，止痙定搐；牛膝通經除痹[9]。諸藥合用有益氣補脾腎、祛濕、降濁、通竅作用[9]。

實驗通過比較大鼠左足趾腫脹程度及軟骨組織中炎癥細胞數量，來觀察除濕通痹方是否具有消炎、抗腫的功效。且IL-1是炎癥級聯放大效應的關鍵環節，主要以IL-1β形式存在關節內，是炎癥調節的始動因素[10-12]。因此抑制IL-1β是防治痛風性關節炎的有效途徑。結果顯示：各給藥組平均光密度值顯著低于模型組(P<0.05)；陽性組、除低組、除中組與除高組比較，差異顯著(P<0.05)。說明各給藥組對IL-1β、IL-1R的表達有抑制作用，其中，除濕通痹方高劑量組抑制作用較除濕通痹方低劑量組、中劑量組強。本研究結果為除濕通痹方治療急性痛風性關節炎提供了實驗依據，為中醫藥治療急性痛風性關節炎提供實驗數據。除濕通痹方可用于急性痛風性關節炎的治療,其作用機制可能與阻斷關節軟組織內IL-1β和IL-lR的表達有關。