應用菌刺洗脫法高效分離猴頭菇單孢

龔文兵 謝純良 周映君 朱作華 王亞惠 彭源德

（中國農業科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

猴頭菇[Hericium erinaceus(Bull.) Pers]，是一種極為重要的食藥用菌，因外形酷似猴頭而得名。猴頭菇進入人們的飲食由來已久，《臨海水土異物志》中稱：“民皆好啖猴頭羹，雖五肉臛不能及之?！焙镱^菇栽培起源于中國，是我國目前常規栽培的食藥用菌之一[1]。

自1994年Kawagishi等[2]從猴頭菇菌絲體中發現一類鳥巢烷型二萜類化合物（猴頭菌素），并報道該類化合物具有促進神經生長因子合成活性以來，猴頭菇中的二萜類化合物受到了廣泛的關注。目前已經從猴頭菇中分離到 25種鳥巢烷型二萜類化合物[3-4]。此外，猴頭菇中還含有其他類型的活性成分，包括多糖、甾體化合物、生物堿類化合物等，具有保肝護胃、抗癌、抗氧化等多種功效[4]。多年來圍繞猴頭菇的研究報道主要集中于活性物質的提取與鑒定[5]，而對其遺傳育種的研究嚴重滯后，導致新品種選育進程緩慢，嚴重影響了猴頭菇產業的健康發展。

優良的菌種是食藥用菌產業可持續發展的基礎，雜交育種是食藥用菌品種選育中應用最廣泛、成效最顯著的育種方法之一[6]。猴頭菇是異宗結合擔子菌，減數分裂后產生有性擔孢子[7-8]?？梢岳脝捂呔昱鋵M行猴頭菇雜交育種，獲得性狀優良的新品種。雜交育種中最關鍵的環節是通過單孢分離獲得單核體。與香菇等傘菌一樣，在猴頭菇中通常采用子實體懸掛法分離單孢[7,9]。其方法是將整個子實體置于無菌的孢子收集器中彈射孢子1天左右，制備孢子懸浮液，連續稀釋后接種于培養基，再獲得單孢菌株。由于猴頭菇子實體表面不光滑，擔孢子著生于裸露的菌刺上，采用子實體懸掛法分離單孢污染率較高，并且操作時間長。本試驗建立一種簡單快速的單孢分離方法，旨在推動猴頭菇的遺傳育種研究。

1 試驗材料

1.1 供試菌株

供試菌株為猴頭菇雜交子HeC9，由‘常山猴頭菇’和‘猴頭911’的單核體菌株配對獲得。‘常山猴頭’和‘猴頭 911’菌株由四川省農業科學院土壤肥料研究所王波老師提供。

1.2 供試培養基

MEA培養基：麥芽浸粉 30.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，瓊脂15.0 g，水1 000 mL。

100 mg/mL氨芐青霉素配置：稱取5 g氨芐青霉素置于50 mL 離心管中，加入40 mL無菌水，充分混勻后定容至50 mL。采用0.22 μm 濾膜過濾，滅菌，分裝后置于-20 ℃下保存備用。

2 試驗方法

2.1 孢子采集

參照于海龍等[10]的方法進行猴頭菇栽培，子實體八成熟時采收。在超凈工作臺上，用75%的酒精對猴頭菇子實體進行消毒。分兩種方法收集單孢，一為子實體懸掛彈射法。選擇9個猴頭菇子實體進行單孢分離，用滅菌的500 mL 燒杯作為孢子收集器收集單孢，孢子彈射時間為24 h。另一為菌刺洗脫法。將2 μL 100 mg/mL氨芐青霉素加入含有2 mL無菌水的離心管中，用無菌的鑷子挑取1個猴頭菇子實體上的9根菌刺，放入上述氨芐青霉素溶液中清洗數次，再將清洗后的菌刺放入含有2 mL 無菌水的離心管中搖晃數次，即制成猴頭菇孢子懸浮液（菌刺洗脫法）。每根菌刺制備1管孢子懸浮液。

2.2 單孢分離

采用連續稀釋法進行猴頭菇孢子的分離。通過連續稀釋孢子液，使孢子分散到較低濃度，再取200 μL稀釋后的猴頭菇孢子懸浮液，用玻棒均勻涂布于含有氨芐青霉素的MEA培養基中（20 mL培養基中加入20 μL 100 mg/mL氨芐青霉素），然后將培養皿置于恒溫箱內，25 ℃避光培養。

2.3 單核菌絲鑒定

待孢子萌發至肉眼可見，即刻挑取單菌落，置于新培養基中繼續培養。待培養皿中的菌落長到1～2 cm時，置于顯微鏡下觀察，沒有鎖狀聯合即是由擔孢子萌發而生成的單核菌絲。

采用子實體懸掛彈射法分離單孢作為對照，選取整個猴頭菇子實體制備孢子懸浮液，再用無菌水連續稀釋進行單孢分離[9]。

3 結果與分析

3.1 兩種單孢分離方法的比較

試驗結果表明，子實體懸掛彈射法中，2個子實體在孢子收集器中感染真菌，棄用；4個子實體獲得了孢子懸浮液，經連續稀釋后涂布于MEA培養基，所有的平皿全部感染細菌；僅有3個猴頭菇子實體獲得了單菌落，成功率為33.3%。在菌刺洗脫法中，隨機選擇1個猴頭菇子實體上的9根菌刺制備了9組孢子懸浮液，經過稀釋、涂平皿后，有1組孢子懸浮液平皿感染細菌，其余8組獲得了單菌落，成功率為88.9%。

單孢分離能否成功，與操作難易程度、操作者的分離技術等相關。新鮮猴頭菇從開放的環境中采收，子實體上的雜菌較多，尤其是細菌。子實體懸掛彈射法中，雖然用75%的酒精對猴頭菇子實體進行了消毒，但由于子實體較大，表面不光滑，菌刺較多，難以消毒徹底。而菌刺洗脫法只需對挑取的單根菌刺進行抑菌消毒處理，消毒效果要好得多，這是菌刺洗脫法能夠顯著降低污染率的主要原因。此外，與子實體懸掛彈射法比較，菌刺洗脫法無需專門的孢子收集器，直接用無菌水將猴頭菇菌刺上的孢子洗下來，操作簡單，也不用等待孢子彈射，縮短了單孢分離的時間。

3.2 稀釋濃度對挑取單菌落的影響

獲得孢子懸浮液后，采用連續稀釋法進行猴頭菇孢子的分離。菌刺洗脫法中，稀釋了3個濃度梯度（10-1、10-2、10-3）。在子實體懸掛彈射法中，稀釋了 6 個濃度梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6）。每種濃度孢子懸浮液涂布5個含有MEA培養基的平皿。涂皿結果（表 1）表明，菌刺洗脫法中，10-1濃度的孢子懸浮液所涂平皿，萌發的單菌落很密集，單個平皿中的單菌落數大于等于100個，難以挑取單菌落到新的培養基上。10-2濃度的孢子懸浮液，孢子萌發的單菌落數量比較適中，單個平皿的單菌落數多介于 10～50個之間，易于挑取單菌落。10-3濃度的孢子懸浮液所涂平皿單菌落偏少，單個平皿單菌落不足10個。子實體懸掛彈射法中，4個稀釋濃度（10-1、10-2、10-3、10-4）的孢子懸浮液所涂平皿上單菌落密集，難以挑取單菌落。10-5濃度的孢子懸浮液所涂平皿，孢子萌發的單菌落數量比較適中。10-6濃度的孢子懸浮液所涂的平皿上單菌落較少（表1）。這可能是由于猴頭菇單根菌刺上的孢子數量遠遠低于其整個子實體上的孢子數量。孢子懸浮液的稀釋倍數影響后續挑取單菌落的難易程度。可以在涂皿前，取孢子懸浮液進行鏡檢，視野中有3～5個孢子的懸浮液濃度較適宜。

表1 稀釋濃度與單菌落數量的關系

3.3 單核菌絲鏡檢結果

利用菌刺洗脫法，總共獲得了240個單菌落。對這些萌發的菌株進行顯微鏡觀察鑒定，若無鎖狀聯合的可初步認為是單孢萌發而生成的單核菌絲，有鎖狀聯合的為雙核菌絲。結果顯示，單核菌絲較雙核菌絲細，挑取的240個菌株中，222個是單核菌株（圖1），其余18個菌株是具有鎖狀聯合的雙核菌株（圖2），采用菌刺洗脫法分離獲得的單核菌株比例為92.5%。萌發的雙核菌絲可能是由于挑取的菌落中包含了可以配對的單孢。

圖1 猴頭菇單核菌絲

圖2 猴頭菇雙核菌絲

4 結 論

由于猴頭菇子實體表面布滿菌刺，而擔孢子著生于裸露的菌刺上，采用傳統的子實體懸掛法分離單孢成功率不高。本研究建立了一種簡單易行的猴頭菇單孢分離方法，對推動猴頭菇遺傳育種研究具有積極意義。與子實體懸掛彈射法相比，最大的不同在于本方法是利用易于消毒的猴頭菇菌刺，將菌刺上的單孢直接洗下來，非常簡單、方便，不需專門的孢子收集器。在降低污染率的同時，也縮短了單孢分離的時間，是一種切實可行的單孢分離手段。除了猴頭菇，本方法還可以推廣到其他食藥用菌品種，挑取小塊著生孢子的組織進行消毒抑菌處理，將孢子沖洗下來后再分離單孢，尤其適合子實體表面不光滑，難以進行消毒的菇類。