小麥 TaHTAS-5A基因的克隆、表達(dá)分析及亞細(xì)胞定位

劉 燕,趙 毅,呂 千,張 麗,李立群,李學(xué)軍

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

植物在其生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)不可避免的遭遇各種各樣的逆境脅迫，這使得植物必須發(fā)展有效的機(jī)制來適應(yīng)環(huán)境脅迫才能更好的生存繁殖[1]。在糧食作物中，小麥占據(jù)非常重要的地位，然而隨著全球氣候的不斷惡化，高溫、干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫嚴(yán)重限制了小麥的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的提高[2-3]。因此，克隆關(guān)鍵的抗逆相關(guān)基因，研究其在非生物脅迫下的防御機(jī)制并利用基因工程手段培育多重抗性的小麥新品種具有重大意義[4]。近年來，越來越多的非生物脅迫調(diào)控基因被發(fā)現(xiàn),并且它們?cè)诿{迫響應(yīng)中的功能也已經(jīng)在擬南芥中得到了充分的驗(yàn)證[5-6]；許多研究揭示，植物是通過重新調(diào)節(jié)代謝和基因表達(dá)來獲得對(duì)非生物脅迫的耐受性的[7-9]。研究表明，泛素化途徑可能影響植物對(duì)各種非生物脅迫的耐受性[10-12]，泛素26S蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)參與許多生物過程，包括細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和逆境脅迫響應(yīng)等[13-17]。近年來，泛素系統(tǒng)中RING 型E3泛素連接酶基因參與非生物脅迫的研究越來越多，擬南芥C3H2C3型RING型E3泛素連接酶AtAIRP1是一個(gè)對(duì)干旱脅迫的脫落酸依賴性反應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子[18]；水稻 OsDIS1基因編碼了一個(gè)C3HC4 Ring finger E3泛素連接酶，該基因在干旱脅迫中通過復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)多種脅迫因子起到負(fù)調(diào)控作用[19]。在水稻中，泛素連接酶基因OsHTAS受高溫、低溫、鹽、ABA和過氧化氫的誘導(dǎo)，是一個(gè)多逆境響應(yīng)基因，并且在水稻苗期對(duì)高溫具有一定的耐受性[20]，但該基因在小麥中參與非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制還未見報(bào)道。因此，本研究利用同源克隆技術(shù)從小麥中分離 TaHTAS-5A基因，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)特性及亞細(xì)胞定位進(jìn)行初步分析，并通過qRT-RCR技術(shù)分析該基因在小麥不同組織及不同非生物脅迫下的表達(dá)模式，以期為更加深入的研究 TaHTAS-5A基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為普通小麥品種中國(guó)春(Chinese Spring, CS)，用于基因的克隆和表達(dá)分析。缺體-四體材料N5AT5D、N5BT5A和N5DT5A，用于染色體定位。

1.2 方 法

1.2.1 材料處理

取CS的種子，先用70%的酒精和0.1%的次氯酸鈉依次進(jìn)行表面消毒，再用無(wú)菌水沖洗3次，然后將種子均勻放置在含有兩層濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，于25 ℃條件下進(jìn)行水培(2 d更換一次水)，10 d后對(duì)小麥幼苗進(jìn)行脅迫處理。干旱脅迫處理：將蒸餾水換成等量的20%的PEG-6000溶液；鹽脅迫處理：將蒸餾水換為等量的200 mmol·L-1的氯化鈉溶液；ABA脅迫處理：將蒸餾水換為100 μmol·L-1的ABA溶液；高溫脅迫處理：將待處理材料放入42 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；低溫脅迫處理：將待處理材料放入4 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別取脅迫處理0、3、6、9、12和24 h的葉片，迅速放進(jìn)液氮冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

在田間小麥抽穗期，剪取其根、莖、葉和幼穗不同組織，將所有樣品均放入液氮中冷凍，在-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA提取及cDNA 第一鏈合成

使用Trizol試劑(華越洋，北京)提取小麥的不同組織及不同脅迫處理材料的總RNA，利用FastQuant RT Kit(with gDNase)(天根，北京)合成cDNA第一鏈，置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3TaHTAS基因的克隆及染色體定位

根據(jù)水稻(Oryzasativa)OsHTAS[21]基因的登錄號(hào)(LOC_Os09g15430)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索其核苷酸序列，以水稻OsHTAS序列為探針，在小麥URGI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://urgi.versailles.inra.fr/blast/)進(jìn)行blast，根據(jù)得到的小麥基因序列，利用Primer 5.0軟件在開放閱讀框外設(shè)計(jì)特異性PCR引物cF/R(表1)。

以CS的cDNA為模板，使用cF/R引物進(jìn)行擴(kuò)增， PCR體系與程序參考2×Taq MasterMix(康為世紀(jì)，中國(guó))說明書，其中循環(huán)數(shù)為36，退火溫度為60 ℃，延伸時(shí)間為1 min 40s。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將目的條帶回收純化，將純化產(chǎn)物連接至克隆載體 pEASY-T1(全式金，北京)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(天根，北京)，經(jīng)PCR鑒定的陽(yáng)性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://urgi.versailles.inra.fr/blast/)中AABBDD間核酸序列差異設(shè)計(jì)引物rF/R，利用中國(guó)春缺-四體材料進(jìn)行染色體定位。

表1 本研究使用的引物信息Table 1 Primer information used in this study

1.2.4 小麥 TaHTAS-5A基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

采用ExPASy-Protparam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)對(duì)TaHTAS-5A蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)；應(yīng)用CBS-NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)目的蛋白磷酸化位點(diǎn)；用SOPMA(https://npsa- prabi.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對(duì)TaHTAS-5A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過SMART(http://smart.embl.heidelberg.del)對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；使用PSORT Prediction(http://psort.hgc.jp/form.html)對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位。將 TaHTAS-5A基因編碼蛋白序列提交到NCBI上進(jìn)行Blast，獲得多個(gè)與 TaHTAS-5A同源的物種的氨基酸序列，然后用Clustal軟件對(duì)小麥TaHTAS-5A蛋白序列與水稻、大麥(Hordeumvulgare)、大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、谷子(Setariaitalic)、粗山羊草(Aegilopstauschii)和高粱(Sorghumbicolor)等同源蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，運(yùn)用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 小麥 TaHTAS-5A的表達(dá)模式分析

根據(jù)測(cè)序所得 TaHTAS-5A序列，參照qRT-PCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)目標(biāo)基因特異性引物qF/R，以小麥18S RNA做內(nèi)參(表1)。用Faststart Essential DNA Green Master(2x)(Roche，德國(guó))熒光染料進(jìn)行基因表達(dá)分析，在Roche96 qRT-PCR擴(kuò)增儀(Roche，德國(guó))上進(jìn)行qRT-PCR，試驗(yàn)設(shè)計(jì)三個(gè)生物學(xué)重復(fù)和三個(gè)技術(shù)重復(fù)，擴(kuò)增體系與程序參考Faststart Essential DNA Green Master(2x)說明書，其中循環(huán)數(shù)為45，退火溫度為63 ℃，基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT方法[22]計(jì)算。

1.2.6 小麥TaHTAS-5A的亞細(xì)胞定位

設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)(BSTE1酶切位點(diǎn)，下劃線標(biāo))的特異引物YF/R(表1)，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物連到經(jīng)相同內(nèi)切酶酶切的1302-2myc-EGFP載體(本實(shí)驗(yàn)室保存)上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，獲得融合載體1302-2myc-EGFP- TaHTAS-5A。采用注射煙草表皮細(xì)胞的方法，將表達(dá)載體導(dǎo)入煙草表皮細(xì)胞，并置于22 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～36 h后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光蛋白在煙草表皮細(xì)胞的位置，未插入 TaHTAS-5A基因的1302-2myc-EGFP空載體作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaHTAS-5A基因的克隆結(jié)果及序列分析

使用特異擴(kuò)增引物cF/R以小麥CS的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在接近1 600 bp處得到一條與預(yù)期大小一致的目的條帶(圖1A)，將目的條帶進(jìn)行回收、轉(zhuǎn)化，測(cè)序得到了三條不同的序列，將其翻譯為氨基酸與水稻OsHTAS氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，選取與水稻序列同源性最高的一條序列進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，該序列長(zhǎng)度為1 588 bp，包括220 bp的5′UTR，126 bp的3′UTR以及1 242 bp的ORF。另外，將該序列編碼區(qū)翻譯得到的氨基酸序列提交至Phytozome 12數(shù)據(jù)庫(kù)中的Triticumaestivumv2.2(Common wheat)子數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast，發(fā)現(xiàn)該序列與位于小麥5AL染色體上ta_iwgsc_5al_v1_2691783的相似度高達(dá)99%，推測(cè)該基因應(yīng)為ta_iwgsc_5al_v1_2691783的等位變異基因。因此，初步把該基因命名為 TaHTAS-5A。將 TaHTAS-5A的cDNA與數(shù)據(jù)庫(kù)的iwgsc_5al的gDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，明確該基因含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，5A基因組全長(zhǎng)3 819 bp(圖1B)。同時(shí)在小麥urgi數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到相應(yīng)的ta_iwgsc_5b與ta_iwgsc_5d序列。比對(duì)發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)5A基因組序列在1 406 bp處比5B和5D多出127 bp(圖2)。

2.2 TaHTAS-5A的染色體定位結(jié)果

根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到的5A、5B和5D序列之間的差異設(shè)計(jì)引物rF1/R1(表1)，在中國(guó)春缺體材料中擴(kuò)增，在5A缺體中，擴(kuò)不出339 bp的片段，而在5B缺體和5D缺體中卻可以擴(kuò)增跟中國(guó)春一樣的兩條帶(圖3)，因此將該基因定位在5A染色體上，命名為 TaHTAS-5A，并把該序列提交到GenBank，登錄號(hào)為MF967573。

1： TaHTAS-5A 的PCR產(chǎn)物； M：DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)。1:PCR products of TaHTAS-5A; M:DL2000 DNA marker.

圖1TaHTAS-5A的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(A)及基因結(jié)構(gòu)示意圖(B)

Fig.1PCRproduct(A)andgenestructure(B)ofTaHTAS-5A

綠線標(biāo)出的表示A比B、D多出的127 bp的序列。

The green line indicates a fragment of 127 bp in A greater than those in B and D.

圖2TaHTAS基因A、B和D間的序列差異

Fig.2SequencealignmentofTaHTASamongthreesubgenomes

M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL600；1：中國(guó)春；2：水(陰性對(duì)照)；3：中國(guó)春5A缺體-5D四體(N5AT5D)；4：5B缺體-5A四體(N5BT5A)；5：5D缺體-5A四體(N5DT5A)。

M:DNA marker DL600; 1:Chinese Spring; 2:Water(Negative control); 3:Nullisomic 5A-tetrasomic 5D(N5AT5D);4:Nullisomic 5B-tetrasomic 5A(N5BT5A); 5:Nullisomic 5D-tetrasomic 5A(N5DT5A).

圖3TaHTAS-5A的染色體定位分析

Fig.3AnalysisofTaHTAS-5Achromosomemapping

2.3 TaHTAS-5A基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 TaHTAS-5A基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

對(duì) TaHTAS-5A基因編碼蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該蛋白理論分子量為45.62 kD，編碼413個(gè)氨基酸，其中絲氨酸(Ser)含量最高(10.4%)，甲硫氨酸(Met)含量最低(1.2%)，理論等電點(diǎn)為6.72，脂溶指數(shù)(Aliphatic index)為80.75。對(duì)TaHTAS-5A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白主要含有α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角4種結(jié)構(gòu)，所占比例分別為23.49%、49.88%、21.31%和5.33%(圖4A)。蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，TaHTAS-5A蛋白序列包含絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多，有36個(gè)。將TaHTAS-5A蛋白序列與水稻OsHTAS蛋白序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩者之間蛋白序列的相似度約為85%，應(yīng)為OsHTAS在小麥中的同源基因。對(duì)TaHTAS-5A蛋白保守域進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)， TaHTAS-5A包含有一個(gè)與水稻OsHTAS蛋白相同的Ring finger保守結(jié)構(gòu)域(337-377位氨基酸殘基)(圖4B)。TMHMM Server 2.0預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在N端存在4個(gè)跨膜區(qū)域，位置為88-110位氨基酸殘基、120-142位氨基酸殘基、206-224位氨基酸殘基和239-270位氨基酸殘基(圖4B)。

2.3.2 TaHTAS-5A基因編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用NCBI-BlastP進(jìn)行比對(duì)分析得知，小麥的TaHTAS-5A蛋白與粗山羊草(Aegilopstauschii)、大麥(Hordeumvulgare)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)、谷子(Setariaitalic)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)以及水稻等物種的Ring finger結(jié)構(gòu)域高度同源，氨基酸序列同源性在85%～99%之間，其中與粗山羊草(XP_020181552.1)和大麥(BAK03789.1)的同源性最高為99%。進(jìn)化分析表明(圖5)，普通小麥的TaHTAS-5A蛋白與粗山羊草(XP_020181552.1)、大麥(BAK03789.1)等植物處于同一分支，其中與粗山羊草的親緣關(guān)系最近；與高粱(XP_002462211.1)、二穗短柄草(XP_010238064.1)等植物處于另一分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；與雙子葉植物大豆(XP_003543658.1)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.4 TaHTAS-5A基因的表達(dá)模式分析

2.4.1 TaHTAS-5A基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)分析

以提取的不同脅迫處理材料的cDNA作為模板，采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)該基因在干旱、高鹽、ABA、低溫和高溫不同脅迫下葉片的表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在高溫處理下， TaHTAS-5A的表達(dá)量呈明顯下降的趨勢(shì)，在12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最低(圖6A)。ABA處理后，該基因的表達(dá)情況與高溫處理下的表達(dá)趨勢(shì)類似(圖6B)。模擬干旱脅迫處理后，隨著脅迫時(shí)間的增加，該基因的表達(dá)量呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，但整體上基因的表達(dá)量變化幅度不大(圖6C)。在NaCl處理后，該基因表達(dá)量呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，處理12 h時(shí)達(dá)到最低(圖6D)。低溫處理后， 該基因的表達(dá)情況與NaCl處理后的表達(dá)趨勢(shì)類似，在脅迫處理3 h后表達(dá)量達(dá)到最高，之后表達(dá)量逐漸下降(圖6E)。由此可以看出，該基因受低溫強(qiáng)烈誘導(dǎo)。

以上結(jié)果表明， TaHTAS-5A基因的表達(dá)主要受低溫、高溫和ABA的影響，同時(shí)對(duì)干旱和鹽脅迫也有響應(yīng)，也就是說，基因受多種脅迫因子的誘導(dǎo)，可能涉及多種逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2.4.2 TaHTAS-5A基因的組織表達(dá)分析

組織特異性分析結(jié)果顯示， TaHTAS-5A在小麥的根、莖、葉和幼穗中都有表達(dá)，但在葉片和穗中的表達(dá)量明顯高于根和莖(圖6F)。表明該基因的表達(dá)有明顯的組織特異性，推測(cè)其可能在小麥葉片及幼穗生長(zhǎng)發(fā)育和防御體系中發(fā)揮著重要的作用。

A：TaHTAS-5A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，藍(lán)線、紅線、綠線和紫線分別代表α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和隨機(jī)卷曲；B： TaHTAS-5A與OsHTAS氨基酸序列比對(duì)，紅色線條標(biāo)出的為四個(gè)跨膜域，藍(lán)色線條標(biāo)出的為Ring finger結(jié)構(gòu)域。

A：Analysis of the secondary structure of TaHTAS-5A protein. The blue，red, green and purple lines represent the alpha helix, extended strand, beta turn and random coil, respectively; B:The amino acid sequence alignment of TaHTAS-5A and OsHTAS; the red line mark for the four transmembrane domains, and the blue line mark Ring finger domain.

圖4小麥TaHTAS-5A蛋白結(jié)構(gòu)分析

Fig.4StructureanalysisofwheatTaHTAS-5Aprotein

圖5 小麥TaHTAS-5A蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of TaHTAS-5A

2.5 小麥TaHTAS-5A在煙草表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析

PSORT Prediction 的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示， TaHTAS-5A定位于細(xì)胞膜上的可能性最大。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示對(duì)照的1302-2myc-EGFP蛋白分布在煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞膜部位(圖7A),而1302-2myc-EGFP-TaHTAS-5A融合蛋白只在細(xì)胞膜中表達(dá)(圖7B)，這說明該基因確實(shí)定位在細(xì)胞膜上，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，推測(cè)該基因的定位可能與其有4個(gè)跨膜域有關(guān)。

A：高溫(42 ℃ )；B:ABA(100 μmol·L-1);C:干旱(20%PEG6000);D:NaCl(200 mmol·L-1);E:低溫(4 ℃)；F:組織表達(dá)。

A：High temperature(42 ℃);B:ABA(100 μmol·L-1);C:Drought(20% PEG6000);D:NaCl(200 mmol·L-1);E:Low temperature(4 ℃)；F:Tissues expression.

圖6小麥TaHTAS-5A基因在不同非生物脅迫下和不同組織中的表達(dá)模式

Fig.6ExpressionpatternsofTaHTAS-5Ainwheatunderdifferentabioticstressesandindifferenttissues

3 討 論

本試驗(yàn)采取同源克隆的方法從小麥品種中國(guó)春中成功克隆了 TaHTAS-5A基因，經(jīng)氨基酸序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼了一個(gè)E3泛素連接酶典型的Ring finger保守結(jié)構(gòu)域，N端具有四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，這與前人在水稻上報(bào)道的OsHTAS蛋白N端包含4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、C端包含一個(gè)RING finger結(jié)構(gòu)域的研究結(jié)果相一致，OsHTAS是E3泛素鏈接酶，在泛素降解路徑中起著至關(guān)重要的作用[20]，所以根據(jù)其相似的結(jié)構(gòu)，推測(cè) TaHTAS-5A也可能屬于一種泛素連接酶，參與逆境脅迫的調(diào)控。蛋白磷酸化是植物應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境，提高自我免疫和信號(hào)響應(yīng)的一種重要保護(hù)機(jī)制，蛋白的磷酸化/去磷酸化修飾也在信號(hào)傳遞過程中起到開關(guān)的作用，它可以調(diào)控生物個(gè)體對(duì)外界脅迫的響應(yīng)[23-24]。TaHTAS-5A蛋白序列具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，由此推測(cè)該蛋白可能也會(huì)通過基因內(nèi)部的磷酸化參與小麥在逆境脅迫下生長(zhǎng)應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[25]。

亞細(xì)胞定位結(jié)果表明， TaHTAS-5A基因主要是在細(xì)胞膜上表達(dá)，沒有特定的核定位功能。這可能與其蛋白含有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域有密切的關(guān)系，之前也有研究顯示，RING型鋅指蛋白經(jīng)常會(huì)含有的跨膜域可能與其參與的泛素降解途徑有關(guān)[26]， TaHTAS-5A蛋白也包含RING finger 結(jié)構(gòu)域與四個(gè)跨膜域。從而推測(cè)， TaHTAS-5A也可能參與泛素的降解途徑，從而參與小麥的非生物脅迫反應(yīng)的調(diào)控。

qRT-PCR結(jié)果表明， TaHTAS-5A基因?qū)Ω邷亍⒌蜏亍⑼庠碅BA有強(qiáng)烈響應(yīng)，干旱和鹽脅迫對(duì)其表達(dá)量的影響不明顯，但也有使其增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在高溫與外源ABA脅迫下，該基因表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)，該基因受低溫強(qiáng)烈誘導(dǎo)呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)，可見，該基因表達(dá)受多種脅迫影響，這與Liu[20]等在水稻中的研究結(jié)果相一致，由此表明 TaHTAS-5A可能涉及多種脅迫信號(hào)傳導(dǎo)，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中扮演了一個(gè)極其復(fù)雜的角色。在實(shí)際生產(chǎn)中，水稻苗期一般在炎熱的夏季，很容易遭受高溫脅迫，所以研究該基因在水稻苗期耐高溫具有重要意義。qRT-PCR的結(jié)果表明該基因?qū)Φ蜏亍⒏邷赜袕?qiáng)烈的響應(yīng)，而小麥在苗期經(jīng)受越冬的過程，會(huì)遭受到低溫脅迫，灌漿后期也常會(huì)遇到高溫天氣，對(duì)于小麥而言，研究該基因?qū)γ缙诘蜏亍⒊墒炱诟邷孛{迫的耐受性更有意義，所以本課題組后續(xù)會(huì)重點(diǎn)研究該基因在小麥低溫、高溫脅迫中的作用。

A：對(duì)照1302-2myc-EGFP空載定位；B：TaHTAS-5A蛋白定位。

A：The localization of control 1302-2myc-EGFP empty vector；B:The localization of TaHTAS-5A protein.

圖7小麥TaHTAS-5A基因在煙草表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析

Fig.7SubcellularlocalizationofwheatTaHTAS-5Ageneintobaccoepidermalcells