山東省14例輸入性卵形瘧原蟲(chóng)wallikeri亞種的鑒定

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瘧疾是由瘧原蟲(chóng)引起的一種蟲(chóng)媒寄生蟲(chóng)病，是世界上危害最嚴(yán)重的熱帶病之一。寄生于人體的瘧原蟲(chóng)有5種，即間日瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumvivax)、惡性瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)、三日瘧原蟲(chóng)(P.malariae)、卵形瘧原蟲(chóng)(P.ovale)和諾氏瘧原蟲(chóng)(P.knowlesi)。隨著全國(guó)瘧疾消除計(jì)劃的有效推進(jìn)，目前國(guó)內(nèi)本地感染病例大幅下降，但由于國(guó)際交往及勞務(wù)輸出人員的日益增加，由此帶來(lái)的輸入性瘧疾病例卻有逐年增加的態(tài)勢(shì)[1]。2015年全國(guó)輸入性瘧疾病例數(shù)為3 248例，較2014年(3 021例)增加了7.5%，其中，山東省212例，全部為輸入性病例，較2014年(150例)增加了41.3%[2]。

山東省輸入性病例主要為惡性瘧，間日瘧次之，偶見(jiàn)卵形瘧和三日瘧[3]。根據(jù)全國(guó)瘧疾消除計(jì)劃，每個(gè)瘧疾病例必須通過(guò)省級(jí)鏡檢復(fù)核、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)符合。巢式PCR系統(tǒng)由Snounou在1993年(NP-1993)開(kāi)發(fā)并在各省瘧疾診斷參比實(shí)驗(yàn)室中推廣[4]。2012-2013年，遼寧、海南、貴州、河南、上海和浙江等省(市)先后出現(xiàn)自非洲輸入的若干特殊瘧疾病例，其鏡檢結(jié)果為卵形瘧原蟲(chóng)，但瘧疾快速檢測(cè)試劑盒(RDT)或NP-1993常規(guī)巢式PCR檢測(cè)結(jié)果卻呈陰性，部分樣本被送至國(guó)家瘧疾診斷參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)核鑒定，結(jié)果顯示這些病例感染的是卵形瘧原蟲(chóng)wallikeri亞種(P.ovalewallikeri)，而非curtisi亞種(P.ovalecurtisi)，而NP-1993 檢測(cè)體系僅對(duì)curtisi亞種敏感[5]。

P.ovalecurtisi和P.ovalewallikeri兩個(gè)亞種最初被命名為CDC-type 和LS-type，是1995年Li等[6]發(fā)現(xiàn)的，這兩種卵形瘧原蟲(chóng)SSU rRNA的序列同源性僅為91.5%。隨后，陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，P.ovalecurtisi和P.ovalewallikeri在動(dòng)合子表面蛋白基因、細(xì)胞色素B基因、絲氨酸蛋白基因、核糖體基因、線粒體基因、核基因、以及蚊體內(nèi)發(fā)育所必需的基因均有差異，因此，最終將經(jīng)典型P.ovale定義為curtisi，將變異型P.ovale定義為wallikeri[7-9]。現(xiàn)將山東省14例輸入性P.ovalewallikeri亞種實(shí)驗(yàn)室鑒定分析結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1樣本來(lái)源 14例樣本均為山東基層疾病預(yù)防控制中心(CDC)或醫(yī)療機(jī)構(gòu)上報(bào)的瘧疾病例抗凝全血。陰性對(duì)照血樣為本單位職工健康體檢者的抗凝全血。采集血樣和進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的所有病例均獲得患者本人及家屬的知情同意。

1.2主要試劑 QIAamp DNA Mini Kit(德國(guó)Qiagen公司)；2×Taq PCR StarMix(北京GenStar公司)；DNA marker(日本Takara公司)。

1.3血涂片厚薄血膜鏡檢 采集患者抗凝全血或末梢血制作帶有厚薄血膜的標(biāo)準(zhǔn)血涂片，干燥，固定后行吉氏染色，油鏡下鏡檢瘧原蟲(chóng)。

1.4RDT檢測(cè) 參照說(shuō)明書(shū)對(duì)14例患者血樣進(jìn)行RDT檢測(cè)。取5 μL全血，垂直加入檢測(cè)卡上加樣孔A內(nèi)，然后在樣品孔B上垂直滴加4滴裂解液，15 min內(nèi)判讀結(jié)果。

1.5瘧原蟲(chóng)DNA的提取 按照QIAamp DNA Mini Kit說(shuō)明書(shū)提取瘧原蟲(chóng)基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6NP-1993常規(guī)巢式PCR擴(kuò)增 以提取的瘧原蟲(chóng)DNA為模板，進(jìn)行常規(guī)巢式PCR擴(kuò)增[3-4]。首先，使用瘧原蟲(chóng)屬特異性引物rPLU5/rPLU6進(jìn)行第1輪擴(kuò)增；然后以第1輪產(chǎn)物為模板，分別使用rFAL1/rFAL2(惡性瘧原蟲(chóng))、rVIV1/rVIV2(間日瘧原蟲(chóng))、rMAL1/rMAL2(三日瘧原蟲(chóng))和rOVA1/rOVA2(卵形瘧原蟲(chóng))進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，產(chǎn)物預(yù)期大小應(yīng)分別為205 bp、120 bp、144 bp、800 bp。

1.7p.ovalewallikeri亞種的PCR檢測(cè) 以提取的瘧原蟲(chóng)DNA為模板，引物rPLU1：5′-CCCTACTACTTGATGGTCCTCA-3′和rPLU5：5′-TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA-3′進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，以第一輪產(chǎn)物為模板，分別以rOVA1WC：5′-TGTAGTATTCAAACGCAGT-3′和rOVA2WC：5′-TATGTACTTGTTAAGCCTTT-3′，預(yù)期產(chǎn)物應(yīng)為660 bp，此輪擴(kuò)增可同時(shí)檢測(cè)P.ovalecurtisi和P.ovalewallikeri兩個(gè)亞種；以rOVA1v：5′-ATCTCCTTTACTTTTTGTACTGGAGA-3′和rOVA2v：5′-GGAAAAGGACACTATAATGTATCCTAATA-3′為引物，預(yù)期產(chǎn)物應(yīng)為780 bp，此輪擴(kuò)增檢測(cè)卵形瘧原蟲(chóng)P.ovalewallikeri亞種。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，剩余用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

2 結(jié) 果

2.1血涂片厚薄血膜鏡檢結(jié)果 14例山東省網(wǎng)報(bào)卵形瘧病例經(jīng)基層疾控中心或醫(yī)療機(jī)構(gòu)鏡檢的初檢結(jié)果：11例卵形瘧，3例間日瘧；山東省瘧疾診斷參比實(shí)驗(yàn)室鏡檢的復(fù)檢結(jié)果：13例卵形瘧，1例間日瘧。

大多數(shù)病例顯微鏡下卵形瘧原蟲(chóng)形態(tài)較典型，少數(shù)在國(guó)外多次不規(guī)范用藥病例的瘧原蟲(chóng)形態(tài)不典型，不易與三日瘧和間日瘧原蟲(chóng)相區(qū)別。油鏡下可見(jiàn)薄血膜中感染原蟲(chóng)的紅細(xì)胞變形明顯，未脹大或略脹大，呈橢圓形、帶毛刺、傘矢狀、拖尾、水滴狀等多種不規(guī)則形狀，紅細(xì)胞邊緣多呈鋸齒狀、凹凸不齊；厚薄血膜中環(huán)狀體、大滋養(yǎng)體、裂殖體(成熟、未成熟)及配子體(雌、雄)等多期卵形瘧原蟲(chóng)均有所見(jiàn)，大滋養(yǎng)體、裂殖體居多，晚期環(huán)狀體比早期典型環(huán)狀體偏多，配子體較少。14例患者薄血膜中的環(huán)狀體含1個(gè)紅色核，胞漿較粗厚；大滋養(yǎng)體多含1個(gè)較粗大紅色核(多個(gè)病例見(jiàn)到2個(gè)核的情況)，不規(guī)則阿米巴樣藍(lán)色胞漿，空泡多明顯、常見(jiàn)較大黃棕色瘧色素顆粒；裂殖體略大于正常紅細(xì)胞，多含6～10個(gè)裂殖子，多數(shù)與聚集中間的瘧色素塊一起，形似“菊花狀”；配子體典型，較大，多含散在、粗大棕黃色瘧色素，核周淡染帶明顯。裂殖體、配子體含瘧色素相對(duì)較多。厚血膜原蟲(chóng)數(shù)量較多，形態(tài)較典型，但與三日瘧和間日瘧原蟲(chóng)很難鑒別，見(jiàn)圖1。

a、b：環(huán)狀體；c、d：晚期環(huán)狀體；e、f：大滋養(yǎng)體；g、h：未成熟裂殖體；i、j：裂殖體；k、l：雌配子體；m-p：大滋養(yǎng)體、未成熟裂殖體、裂殖體；a-l薄血膜；m-p厚血膜圖1 部分P.ovale wallikeri亞種卵形瘧原蟲(chóng)的鏡下形態(tài)Fig.1 Microscopic structure characteristics of P.ovale wallikeri

2.2RDT結(jié)果 14份血樣利用瘧疾快速診斷試紙條進(jìn)行檢測(cè)，其中，12例血樣為質(zhì)控和T2出現(xiàn)反應(yīng)線，提示為間日瘧、卵形瘧、三日瘧單一感染或混合感染；2例血樣僅出現(xiàn)質(zhì)控反應(yīng)線，結(jié)果為陰性。

2.2NP-1993常規(guī)巢式PCR結(jié)果 利用NP-1993常規(guī)巢式PCR對(duì)14份血樣進(jìn)行惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng)和卵形瘧原蟲(chóng)的檢測(cè)，PCR結(jié)果均為陰性，部分結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3P.ovalewallikerii亞種的PCR檢測(cè)結(jié)果 采用改進(jìn)引物進(jìn)行P.ovalewallikeri亞種的PCR檢測(cè)，14份血樣在第二輪PCR擴(kuò)增中，分別得到660 bp和780 bp的條帶，而P.ovalecurtisi僅得到660 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，見(jiàn)圖3。測(cè)序后經(jīng)Blast比對(duì)，14份血樣均為P.ovalewallikeri亞種感染。

M: DNA標(biāo)志物；1：P.ovale curtisi陽(yáng)性對(duì)照；2-5：5例樣本分別用NP-1993體系中的卵形瘧原蟲(chóng)引物、惡性瘧原蟲(chóng)引物、三日瘧原蟲(chóng)引物和間日瘧原蟲(chóng)引物檢測(cè)結(jié)果；6：陰性對(duì)照?qǐng)D2 部分瘧疾病例NP-1993常規(guī)巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR product of partial cases by NP-1993 conventional nested PCR

3 討 論

自2012年山東省首次發(fā)現(xiàn)輸入性卵形瘧病例以來(lái)，隨著勞務(wù)輸出的人數(shù)增加，輸入性卵形瘧病例有上升趨勢(shì)[3]。本研究中的14例卵形瘧原蟲(chóng)wallikeri亞種感染患者，均有外出務(wù)工或者旅游的境外居留史，且前往的國(guó)家(莫桑比克、科特迪瓦、喀麥隆、赤道幾內(nèi)亞、剛果、安哥拉)均為瘧疾重度流行區(qū)(非洲)。

瘧原蟲(chóng)的蟲(chóng)種鑒定是瘧疾控制或消除的關(guān)鍵步驟之一，對(duì)進(jìn)一步的規(guī)范化治療和精準(zhǔn)防控至關(guān)重要。瘧疾診斷主要有血涂片顯微鏡檢，RDT和PCR三種常規(guī)方法。血液中原蟲(chóng)密度低、混合感染、患者多次不規(guī)范服藥等均可造成瘧原蟲(chóng)形態(tài)發(fā)生變化，無(wú)疑會(huì)增加鏡檢鑒別蟲(chóng)種的難度，從而造成誤診和漏診[10]。同時(shí)，由于卵形瘧原蟲(chóng)在形態(tài)上和三日瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)相似，鏡檢時(shí)容易誤判。本研究14例卵形瘧原蟲(chóng)wallikeri亞種病例中，基層初檢時(shí)3例誤診為間日瘧原蟲(chóng)，因此，僅通過(guò)鏡檢進(jìn)行瘧原蟲(chóng)分類在方法學(xué)上不夠嚴(yán)謹(jǐn)。

RDT法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便直觀，由于缺少除惡性瘧原蟲(chóng)以外的針對(duì)其他瘧原蟲(chóng)的單一特異RDT檢測(cè)試劑，因此，RDT檢測(cè)僅能區(qū)分惡性瘧原蟲(chóng)感染和非惡性瘧的泛瘧原蟲(chóng)感染[10]。同時(shí)，由于RDT受檢測(cè)試劑敏感性的限制，也曾出現(xiàn)誤診陰性的病例。本研究中，就出現(xiàn)了2例RDT陰性誤診。

NP-1993常規(guī)巢式PCR的發(fā)明，極大彌補(bǔ)了RDT法不能有效區(qū)分四種瘧原蟲(chóng)的缺憾。隨著瘧原蟲(chóng)基因變異的發(fā)生發(fā)展，NP-1993體系已經(jīng)不能滿足區(qū)分卵形瘧原蟲(chóng)curtisi和wallikeri兩個(gè)亞種的需要。因此，用于檢測(cè)卵形瘧原蟲(chóng)wallikeri亞種的引物應(yīng)運(yùn)而生。本研究應(yīng)用的rOVA1WC/rOVA2WC能同時(shí)擴(kuò)增卵形瘧原蟲(chóng)curtisi和wallikeri亞種而產(chǎn)生660 bp的陽(yáng)性條帶，而rOVA1v/rOVA2v僅能擴(kuò)增卵形瘧原蟲(chóng)wallikeri亞種產(chǎn)生780 bp的陽(yáng)性條帶，因此，能有效區(qū)分卵形瘧原蟲(chóng)curtisi和wallikeri亞種。

M: DNA標(biāo)志物；1-14：1-14例樣本；15：P.ovale curtisi對(duì)照；16：陰性對(duì)照?qǐng)D3 14例P.ovale wallikeri亞種的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR result of P.ovale wallikeri with 14 malaria cases

2010年，中國(guó)政府啟動(dòng)了全國(guó)瘧疾消除計(jì)劃(NMEP)，旨在到2020年在全國(guó)范圍內(nèi)消除瘧疾[11]。自2011年山東省出現(xiàn)最后一例瘧疾本地感染病例以來(lái)，至2017年底，已經(jīng)連續(xù)6年無(wú)本地感染病例，而輸入性病例的增加以及基因變異類型瘧原蟲(chóng)病例的出現(xiàn)，無(wú)疑給醫(yī)療工作者帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。因此，研發(fā)適用于變異型瘧原蟲(chóng)的診斷試劑和檢測(cè)技術(shù)，有利于特殊病例的及早發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)治療，是對(duì)NMEP有效推進(jìn)的技術(shù)保障。