小鼠泡型包蟲囊液對小鼠骨髓來源樹突狀細胞表達IDO的影響

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泡型包蟲病(alveolar echinococcosis,AE)是由多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis,E.m)幼蟲所引起的一類嚴重人獸共患寄生蟲病[1]，我國是該病發病率最高的國家之一[2]，AE蚴囊呈多泡型出芽方式生長，類似惡性腫瘤被稱為“蟲癌”[3]。AE病原泡球蚴具有免疫耐受能力，可以在宿主體內長期寄生不被殺滅[4]，但其具體作用機制尚不明確。樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞(antigen presenting cell,APC)，可以參與機體炎癥反應和免疫耐受[5]，是研究慢性感染疾病調控宿主免疫應答機制的重要靶點[6]。研究表明，一些寄生蟲抗原成分可以誘導宿主DCs 表面吲哚胺 2,3-雙加氧酶(indoleamin 2,3-dioxygenase,IDO)高表達，引起微環境中色氨酸耗竭進而影響了宿主 DCs正常免疫功能，最終介導機體免疫耐受的形成，這一途徑被認為是寄生蟲感染宿主發生免疫耐受的分子機制之一[7]。研究發現，囊性包蟲病(cystic echinococcosis,CE)感染宿主形成的免疫耐受與宿主DCs 表面IDO高表達有關[8]，目前關于AE感染過程中是否同樣具有上調宿主DCs表面IDO的能力，并參與到AE免疫耐受途徑中還不清楚。本研究以小鼠泡型包蟲囊液(multilocular cyst fluid,MCF)與小鼠骨髓來源樹突狀細胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs)共培養為模型，在不同時間點通過Real-time PCR、Western blotting和ELISA等方法動態監測MCF 對BMDCs表面IDO mRNA轉錄水平、蛋白水平以及BMDCs上清液中IDO濃度變化的影響，探討AE免疫耐受與MCF誘導宿主BMDCs表達IDO的關系，為進一步揭示AE感染宿主的免疫耐受分子機制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6～8 周齡SPF級健康C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準，實驗動物使用許可證為SYXK(蘇)2012-0004。

1.2主要試劑及儀器 小鼠泡型包蟲囊液(multilocular cyst fluid,MCF)由新疆醫學動物模型研究重點實驗室提供，小鼠重組粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、小鼠重組II型γ干擾素(rmIFN-γ)購自美國R&D Systems公司，RPMI-1640細胞培養液購自美國 Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購自美國ExCell Biology公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，兔抗鼠IDO多克隆抗體、兔抗鼠GAPDH多克隆抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠 IgG均購自英國Abcam公司，鼠IDO酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國BioSciences公司，其他試劑均為國產分析純。實時熒光定量PCR儀(DA7600)為中國中山達安公司產品，Western 電泳儀(164-5051)和凝膠成像系統(GelDoc 2000)均為美國BIO-RAD公司產品，酶標儀(ELx800)為美國 BioTek公司產品。

1.3小鼠骨髓源樹突狀細胞誘導培養及實驗分組 將C57BL/6小鼠頸椎脫位法處死，無菌狀態下分離股骨和脛骨髓細胞，用RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清)將細胞懸浮，分至6孔培養板中加入rmGM-CSF(終濃度10 ng/mL)和IL-4(終濃度1 ng/mL)，將細胞培養板置5%、CO2培養箱培養48 h，隔天半量換液并補足rmGM-CSF，培養至第7 d，用吸管輕輕吹打后收集所有懸浮細胞，即為富集的小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs)。將誘導培養分離到的BMDCs用 RPMI-1640 培養基重懸調整細胞濃度為1×106cells/mL，分別用MCF(終濃度為5 mg/mL)和rmIFN-γ(終濃度為1 000 U/mL,作為陽性對照組)進行體外培養，同時加入相同體積 RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清)作為陰性對照組，分別在6 h、18 h、24 h、48 h和60 h收集各組細胞和上清液。

1.4BMDCs表面IDO mRNA相對表達量的檢測根據GenBank中小鼠IDO(登錄號：NM_008324.2)和 GAPDH(登錄號：NM_008084.3)序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計引物，引物由江蘇凱基生物技術股份有限公司合成，IDO(F：5′-AGCAATCCCCACTGTATCCA-3′；R：5′-GGTCCACAAAGTCACGCATC-3′)， GAPDH(F：5′-AAGGTCGGTGTGAACGGATT-3′，R：5′-TGAGTGGAGTCATACTGGAACAT-3′)。采用Trizol法提取各組BMDCs總RNA，將提取的RNA 反轉錄合成cDNA第一鏈按試劑盒操作說明書進行。使用SYBR Premix ExTaqTMII 熒光定量試劑盒在熒光定量PCR儀上進行IDO基因相對定量分析。反應體系為20 μL：SYBR Premix ExTaqTMII (2×) 10 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 7 μL。反應程序：95 ℃預變性 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以GAPDH為內參基因進行標準化，對每個樣品進行3個重復測定，所得數據采用相對比較Ct法(Qr=2-△△Ct)分析，以確定IDO mRNA相對表達量。

1.5BMDCs表面IDO蛋白相對表達水平的檢測收集各組不同時間點BMDCs，用胰酶消化后分別加入細胞裂解液充分裂解，4 ℃ 13 000×g 離心 10 min，收集上清即為細胞總蛋白。BCA法檢測各組蛋白濃度后，經 12% SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉染至PVDF 膜上經封閉和漂洗后，分別加入兔抗鼠IDO抗體(稀釋比例1∶50)和兔抗鼠GAPDH(稀釋比例1∶25 000)4 ℃孵育過夜，洗膜后加入羊抗鼠 IgG-HRP二抗(稀釋比例1∶10 000)室溫孵育2 h，洗膜3次后用ECL試劑盒顯色，凝膠成像系統采集圖像并分析，以IDO蛋白條帶灰度值與內參GAPDH蛋白條帶灰度值之比表示目的IDO蛋白的相對表達水平。

1.6BMDCs上清液中IDO濃度的檢測 收集各組不同時間點BMDCs上清液，按照小鼠IDO ELISA試劑盒操作說明書檢測BMDCs上清液中IDO的濃度，每個檢測樣品設立兩個復孔，吸收波長為450 nm。

2 結 果

2.1BMDCs表面IDO mRNA相對表達量動態檢測 采用Real-time PCR方法對陰性對照組、陽性對照組和MCF組5個時間點BMDCs表面IDO mRNA相對表達量進行分析，結果顯示(圖1)，從6 h開始MCF處理組的BMDCs表面IDO mRNA表達量逐漸增高，24 h達到最高值(34.383±1.803)，與陰性對照組(13.289±1.072) 差異有統計學意義(F=303.305，P<0.01)，與陽性對照組(46.884±4.962)差異也有統計學意義(F=16.816，P<0.05)見表1，MCF刺激24 h之后BMDCs表面IDO mRNA相對表達量逐漸下降。

圖1 不同處理組BMDCs的IDO mRNA相對表達量動態變化Fig.1 Dynamic changes of relative expression of IDO mRNA by different treated BMDCs

表1 3組不同時間 BMDCs表面IDO mRNA相對表達量比較Tab.1 Relative expression of IDO mRNA in three groups of BMDCs at different time

注：同一時間點，與陰性對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與陽性對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖2 不同處理組BMDCs中IDO蛋白表達Western boltting動態檢測Fig.2 Western boltting detection of IDO expression by different treated BMDCs

2.2BMDCs表面IDO蛋白相對表達水平動態檢測 采用 Western blotting方法檢測陰性對照組、陽性對照組和MCF組不同時間點BMDCs表面IDO蛋白的表達情況，結果見圖2。MCF處理組從6 h開始BMDCs表達IDO逐漸增加，48 h達高峰之后逐漸減弱(圖3)，MCF處理組IDO蛋白的表達在48 h達高峰延遲于IDO mRNA的表達。48 h時BMDCs表面IDO蛋白及相應 GAPDH 蛋白的灰度值之比MCF組(0.758±0.047)高于陰性對照組(0.503±0.024) (F=70.971，P<0.01)，而MCF組與陽性對照組(0.847±0.067)相比差異無統計學意義(F=3.648，P>0.05)，見表2。

圖3 不同處理組BMDCs中IDO蛋白相對表達水平動態變化Fig.3 Dynamic changes of relative expression of IDO protein by different treated BMDCs

表2 3組不同時間BMDCs表面IDO蛋白相對表達水平比較Tab.2 Relative expression of IDO protein in three groups of BMDCs at different time

注：同一時間點，與陰性對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與陽性對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3BMDCs上清液中IDO濃度動態檢測 采用 ELISA方法檢測陰性對照組、陽性對照組和MCF組不同時間點BMDCs上清液中IDO濃度動態變化，結果顯示(圖4)，從6 h開始MCF組BMDCs上清液中IDO濃度逐漸增高，24 h達到最高值(33.801±0.448 ng/mL)，與陰性對照組(13.811±0.086 ng/mL)和陽性對照組(45.523±0.493 ng/mL)間差異有統計學意義(F=5752.473、927.464，P<0.01)，見表3。MCF刺激24 h之后BMDCs上清液中IDO濃度逐漸下降，5個時間點BMDCs上清液中所檢測的IDO濃度變化趨勢與IDO mRNA表達變化趨勢相一致。

3 討 論

包蟲病是由棘球屬的棘球絳蟲寄生于人和動物體內所引起的一種人獸共患慢性蠕蟲性疾病，該病天然免疫細胞DCs在免疫應答的誘導中發揮關鍵作用[11]，是連接固有免疫與獲得性免疫的橋梁，其活化狀態決定了Th1型細胞和Th2型細胞免疫應答反應的方向，當Th1型細胞向Th2 型細胞發生極化漂移時可以介導機體發生免疫耐受[12]。IDO是肝外唯一催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝的限速酶，是調節宿主 DCs 發生免疫耐受的一個重要分子開關[13]，已有研究表明，囊型包蟲病感染過程中宿主DCs表面IDO高表達可以抑制Th1型細胞正常免疫功能，促使機體產生Th2型反應[14]，并證實Th1/Th2型細胞失衡與囊型包蟲病免疫耐受形成有關聯[15]。本研究以BMDCs與MCF共培養為實驗模型，在不同時間點動態監測BMDCs表達 IDO情況，結果顯示MCF處理組的BMDCs表面IDO mRNA相對表達量和BMDCs上清液中IDO濃度24 h均達到最高值，與陰性對照組差異極顯著(F=303.305、5752.473，P<0.01)，而MCF處理組BMDCs表面IDO蛋白表達水平在48 h達到峰值滯后IDO mRNA轉錄水平，主要原因可能是由泡型包蟲囊液抗原成分復雜造成，不同時間點泡型包蟲囊液誘導BMDCs表達 IDO變化趨勢，與單驕宇用小鼠囊型包蟲囊液誘導BMDCs表達 IDO動態檢測所分析的變化趨勢相一致[8,14]，說明泡型包蟲病和囊型包蟲病感染致宿主樹突狀細胞高表達IDO具有相似性，為進一步研究泡型包蟲病感染過程中宿主DCs表面IDO對Th1/Th2型細胞的影響，以及探討泡型包蟲病免疫耐受的相關分子機制奠定了一定實驗和理論基礎。

圖4 不同處理組BMDCs上清液中IDO濃度動態變化Fig.4 Dynamic changes of IDO concentrations in supernatants by different treated BMDCs

表3 三組不同時間 BMDCs上清液中IDO濃度檢測比較Tab.3 Detection of IDO concentrations in three groups of BMDCs supernatants

注：同一時間點，與陰性對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與陽性對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

在世界范圍內廣泛流行，現已報道的能夠引起人感染棘球絳蟲病原有細粒棘球絳蟲(Echinococusgranulosus,Eg)、多房棘球絳蟲(Echinococusmultilocularis,Em)、少節棘球絳蟲(Echinococusoligathrus,Eo)和伏氏棘球絳蟲(Echinococusvogeli,Ev) 4 種，我國流行區域感染人的棘球絳蟲主要為Eg和Em[9]。AE是由Em引起，主要侵害人或動物的肝臟，呈浸潤方式生長，通過浸潤還可以轉移至肺臟、腦部等其他組織器官而形成轉移病灶。據統計，未經治療的 AE患者 10 年病死率高達 94%，已成為危害人類健康的世界性公共衛生問題之一[10]。目前，AE免疫耐受機制還不清楚，對其進行研究探討有助于尋找新的免疫治療方法以及在探索更為有效的防治思路等方面具有重要的意義。

綜上所述，本研究通過體外實驗證明了AE感染過程中調節宿主免疫應答的主要抗原成分MCF可以誘導BMDCs表面IDO高表達，這一現象提示樹突狀細胞表面IDO高表達可能與泡型包蟲病免疫耐受分子機制的形成有關。然而有關IDO分子調控機制具體所發揮的作用還需通過體內實驗進一步加以驗證，如建立AE感染實驗動物模型，通過收集AE感染不同時期的DCs檢測IDO表達情況和Th1/Th2細胞因子分泌情況，并探討IDO表達對DCs分泌Th1/Th2細胞因子的影響，以確認IDO是否參與AE慢性感染致宿主的免疫耐受過程。