豬帶絳蟲TSOL18基因重組乳球菌疫苗的穩定性分析

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豬囊尾蚴病(cysticercosis cellulosae)是由豬帶絳蟲(Taeniasolium,Ts)的中絳期幼蟲-豬囊尾蚴寄生于人或豬的一種嚴重危害養豬業和人類健康的人獸共患寄生蟲病，在上個世紀，我國是豬囊尾蚴病高發國家之一[1-2]。隨著社會進步，消費者對該病的認識不斷加深，該病在科技工作者的不斷努力之下，發病率急劇下降。豬囊尾蚴可寄生于人體皮下、肌肉、眼、腦、心臟等部位，其中以腦囊蟲病危害最為嚴重，具有較高的致殘率和致死率[3-5]。藥物及手術治療都有其局限性，疫苗防治該病已成為當前研究熱點[6]，并發現了許多免疫原候選基因，如45W、TSOL16、TSOL18等，其中TSOL18基因是豬帶絳蟲六鉤蚴階段重要的免疫原基因，具有良好的免疫原性和免疫保護性，被認為是最具前景的疫苗候選基因之一[7]。

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis,L.lactis)是一種公認的食品級微生物，廣范應用于食品、醫藥等相關領域[8-9]。隨著基因工程技術的發展，選擇具有高效、無毒副作用的L.lactis作為載體已構建了一系列基因工程重組菌[10-14]。本研究擬將豬帶絳蟲重組質粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18電穿孔轉化入L.lactisMG1363，分別在無紅霉素抗性和含紅霉素抗性條件下連續人工傳代20次，通過測定質粒穩定率和SacI/HindIII雙酶切鑒定，測定質粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18在L.lactis中的遺傳穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質粒與菌種 重組質粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18、由本實驗室保存；L.lactisMG1363購于南京鐘鼎生物技術有限公司。

1.1.2主要試劑和儀器 GM17培養基購于美國OXOID公司，DNA Marker、質粒抽提試劑盒購于上海生工生物工程有限公司；紅霉素購自sigma公司；其他試劑均為國產分析純；核酸電泳儀購于北京六一生物科技有限公司；PCR儀購自美國MJ Research公司。

1.2 方法

1.2.1重組質粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18電轉化L.lactisMG1363 以GenBank中登錄的豬帶絳蟲TSOL18基因序列為模板(登錄號為AF017788)，以乳酸菌為宿主系統進行基因優化，采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，設計引物，在其兩端分別加入酶切位點SacI/HindIII以及保護性堿基，在其N端添加SPUSP45分泌信號肽序列，分別合成TSOL18和SP-TSOL18目的基因。將TSOL18和SP-TSOL18目的基因克隆至大腸桿菌-乳球菌穿梭表達質粒pMG36e，構建胞內型重組質粒pMG36e-TSOL18和分泌型重組質粒pMG36e-SP-TSOL18。分別將獲得的pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18質粒與感受態L.lactisMG1363混合，冰浴10 min，電擊。電轉參數如下：電壓200 V，電容25 F，電阻200 Ω，進行第一次脈沖，然后立即加入900 L低溫的GMMC恢復培養基(M17培養基+0.5%葡萄糖+20 mmol/L MgCl2+2 mmol/L CaCl2)，冰上放置10 min，期間不要振動，30 ℃復蘇培養2～3 h，將菌液4 000 r/min離心棄去上清后濃縮于100 μL GMMC中，將其涂布在10 μg/mL的紅霉素GM17平板上，30 ℃培養2～3 d。期間保持相對密閉環境，觀察菌落生長情況，1周左右，陸續形成細小的圓形白色不透明菌落。

選取不同的陽性菌落，分別在每個陽性菌落上使用滅菌牙簽挑取2～3個單菌落，置于1 mL的G/L-SGM17+ 5 μg/mL紅霉素液體培養基中，30 ℃靜置培養72 h，待溶液出現明顯的渾濁后待用。

1.2.2陽性克隆鑒定 取上述培養的菌液，10 000 r/min離心10 min，棄上清，ddH2O洗滌3次，10 000 r/min離心棄上清；加入30 μL的ddH2O，重懸后沸水浴10 min；冰浴2 min，10 000 r/min離心10 min，吸取上清，提取基因組DNA，作為PCR模板待用。使用基因特異性引物進行PCR鑒定，確認陽性克隆后作為表達菌株備用。

1.2.3重組質粒轉化菌的傳代培養 挑取上述鑒定為陽性克隆子的單菌落，分別接種于GM17+(含紅霉素)液體培養基和GM17(不含紅霉素)液體培養基中，30 ℃培養24 h后，4 ℃放置過夜并保種，分別取培養物進行劃線接種于GM17平板，30 ℃培養24 h后，在劃線平板上分別挑取100個單菌落接種于相應含紅霉素的培養基與不含紅霉素的培養基中，30 ℃培養24 h后計數生長菌落，重復以上操作傳至20代，則停止傳代。

1.2.4遺傳穩定率測定和雙酶切鑒定 重組質粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18轉化菌分別在含紅霉素抗性和不含紅霉素的GM17培養基中，30 ℃培養，連續培養20代，每傳5代進行一次遺傳穩定率測定[15-16]，計算其質粒的遺傳穩定性。質粒穩定率=100個單菌落接種于紅霉素平板的菌落生長數。將各代次的重組質粒經限制性內切酶SacI/Hind III雙酶切，酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結 果

2.1陽性克隆鑒定 取L.lactisMG1363、含pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18的培養菌液，吸取上清，提取基因組DNA為模板，使用基因特異性引物進行PCR鑒定，結果顯示，1-6泳道為重組質粒pMG36e-TSOL18轉化L.lactisMG1363陽性菌的PCR產物，見圖1；1-6泳道為重組質粒pMG36e-SP-TSOL18轉化L.lactisMG1363陽性菌的PCR產物，見圖2。均與預期結果相符。

M:DNA Marker;1-6:PCR production of recombinant plasmid pMG36e-TSOL18 transformation bacteria;7:PCR production of L.lactis MG1363 negative bacteria圖1 重組質粒pMG36e-TSOL18轉化菌的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of transformed bacteria of recombinant plasmid pMG36e-TSOL18

M:DNA Marker;1-6:PCR production of recombinant plasmid pMG36e-SP-TSOL18 transformation bacteria;7:PCR production of L.lactis MG1363 negative bacteria圖2 重組質粒pMG36e-SP-TSOL18轉化菌的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of transformed bacteria of recombinant pMG36e-SP-TSOL18

2.2遺傳穩定率測定 PCR鑒定陽性的重組質粒pMG36e-TOSL18和pMG36e-SP-TOSL18在L.lactisMG1363中連續傳代20代時，在不含紅霉素抗性條件下，質粒穩定率均為100%，在含有紅霉素抗性條件下，質粒穩定率均為99%。見表1-4。

表1 L.lactis MG1363中pMG36e-TOSL18質粒在無紅霉素選擇壓力下的遺傳穩定率Tab.1 The genetic stable rate of pMG36e-TOSL18 plasmid in L.lactis MG1363 in the absence of erythromycin selective pressure

表2 L.lactis MG1363中pMG36e-TOSL18質粒在含紅霉素選擇壓力下的遺傳穩定率Tab.2 The genetic stable rate of pMG36e-TOSL18 plasmid in L.lactis MG1363 under the erythromycin selection pressure

表3 L.lactis MG1363中pMG36e-SP-TOSL18質粒在無紅霉素選擇壓力下的遺傳穩定率Tab.3 The genetic stable rate of pMG36e-SP-TOSL18 plasmid in L.lactis MG1363 in the absence of erythromycin selective pressure

表4 L.lactis MG1363中pMG36e-SP-TOSL18質粒在含紅霉素選擇壓力下的遺傳穩定率Tab.4 The genetic stable rate of pMG36e-SP-TOSL18 plasmid in L.lactis MG1363 under the erythromycin selection pressure

2.3雙酶切鑒定 將各代次的重組質粒經限制性內切酶SacI/HindIII雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示大小正確，連續傳至20代時，均有較好的遺傳穩定性，與原代質粒相符。見圖3、4。

M:DNA 標記物;1:轉化pMG36e-TSOL18/L.lactis原代質粒;2:轉化pMG36e-TSOL18/L.lactis原代質粒酶切后;3:轉化pMG36e-TSOL18/L.lactis 5代質粒;4:轉化pMG36e-TSOL18/L.lactis 5代質粒酶切后;5:轉化pMG36e-TSOL18/L.lactis 10代質粒;6:轉化pMG36e-TSOL18/L.lactis 10代質粒酶切后;7:轉化pMG36e-TSOL18/L.lactis 15代質粒;8:轉化pMG36e-TSOL18/L.lactis 15代質粒酶切后;9:轉化pMG36e-TSOL18/L.lactis 20代質粒;10:轉化pMG36e-TSOL18/L.lactis 20代質粒酶切后 圖3 質粒 pMG36e-TSOL18人工傳代后的酶切鑒定Fig.3 Identification of enzyme digestion of the recombinant plasmid pMG36e-TSOL18 after artificial passage

M:DNA標記物;1:轉化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis原代質粒;2:轉化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis原代質粒酶切后;3:轉化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 5代質粒;4:轉化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 5代質粒酶切后;5:轉化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 10代質粒;6:轉化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 10代質粒酶切后;7:轉化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 15代質粒;8:轉化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 15代質粒酶切后;9:轉化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 20代質粒;10:轉化pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis 20代質粒酶切后圖4 質粒pMG36e-SP-TSOL18人工傳代后的酶切鑒定Fig.4 Identification of enzyme digestion of the recombinant plasmid pMG36e-SP-TSOL18 after artificial passage

3 討 論

基因工程重組乳球菌疫苗具有許多優點：1)它是食品和醫藥工業重要的食品級微生物，易培養，基因操作簡便可靠，轉化效率高，重復性好；2)L.lactis是一種革蘭陽性菌，不分泌內毒素，表達的外源蛋白不需純化(可簡化生產工藝，降低生產成本)，可連同菌體直接服用(具有很好的安全性)；3)L.lactis通常不產生細胞外蛋白酶，不會在細胞外對分泌的外源蛋白進行降解；4)L.lactis通常較少分泌自身蛋白，減少了載體自身蛋白對分泌的外源蛋白的干擾；5)外源蛋白既可在細胞內表達，也可在細胞壁進行表達，還可以分泌到細胞外進行表達；6)L.lactis不在胃腸道定植，很少產生免疫耐受；7)口服接種方便，可誘導宿主產生較強的黏膜免疫應答和系統免疫應答[17-18]。因此，針對豬帶絳蟲卵經口感染的特點，選擇L.lactis為載體，制備一種豬帶絳蟲重組乳球菌口服疫苗，可能是預防和控制豬囊尾蚴病較為安全、有效的實用新型疫苗。而疫苗制備的關鍵問題在于菌株的穩定性[19]。質粒的遺傳穩定性是指轉化細胞在生長期間能夠保持一定的穩定性，含有的質粒不發生變化，并且能夠在其生長過程中保留其原始的表型特征，對菌株遺傳穩定性及后續的大規模生產等都有一定的應用價值[15,20-21]。

六鉤蚴階段是囊尾蚴感染的最早也是最重要的階段，此階段的抗原分子可能對蟲卵感染具有更好的抵抗力，其中，TSO45W、TSOL16、TSOL18是應用于囊蟲病疫苗研究的主要抗原分子。研究發現，TSO45W家族包含諸多抗原組份，本課題組驗證以TSO45W-4B為抗原基因構建的重組Bb疫苗的保護率不太令人滿意[22-25]；TSOL16作為疫苗抗原尚未進行保護性研究[26-27]。TSOL18是六鉤蚴階段早期表達的一種特異性抗原，相對較保守，這也表明TSOL18在豬帶絳蟲六鉤蚴階段發揮重要作用，可能與六鉤蚴的入侵有關[28-29]。本研究分別將豬帶絳蟲重組質粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18電穿孔轉化入L.lactis，將獲得的陽性重組pMG36e-TSOL18/L.lactis、pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis轉化菌，在無紅霉素抗性和含紅霉素抗性條件下，連續人工傳代20次，通過質粒遺傳穩定率測定和SacI/HindIII雙酶切鑒定，測定質粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18在L.lactis中的遺傳穩定性。結果表明，含有目的基因的質粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18在L.lactis中連續傳代20代時，在無紅霉素抗性條件下，質粒穩定率均為100%，在含紅霉素抗性條件下，質粒穩定率均為99%，均有較好的遺傳穩定性。將各代次的質粒采用限制性內切酶SacI/HindIII進行雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示大小正確，連續傳至20代時，與原代質粒相符，與代偉麗等[16]和李月等[30]的報道相似。本實驗結果為豬帶絳蟲TSOL18基因重組乳球菌疫苗在動物體內的遺傳穩定性以及免疫應答效果等研究奠定基礎。