魯氏酵母用于發(fā)酵香腸中發(fā)酵生產(chǎn)性能及安全性能研究

高紹金，李志江，趙家圓，韓齊，李艷青

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

魯氏酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii)是傳統(tǒng)豆醬、醬油生產(chǎn)過(guò)程中能夠產(chǎn)生風(fēng)味的微生物，耐鹽性強(qiáng)；產(chǎn)醇類、糖醇類及呋喃酮類風(fēng)味物質(zhì)，并與乳酸曲的代謝產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)[1]，利于香氣的形成；能將谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)化為底物生成谷氨酸，增強(qiáng)鮮味，對(duì)發(fā)酵后熟階段中香氣成分的產(chǎn)生具有至關(guān)重要的作用[2]。

發(fā)酵香腸是指以碎肉、脂質(zhì)為主要原料，與鹽、糖、味精、香料及微生物發(fā)酵劑等混合腌制后灌進(jìn)腸衣，在一定條件下發(fā)酵而成的發(fā)酵肉制品[3-6]。發(fā)酵香腸中常用的發(fā)酵劑菌株是乳酸菌、接觸酶陰性球菌(主要是葡萄球菌屬和考克斯菌屬)以及酵母和霉菌[7]。發(fā)酵香腸不僅風(fēng)味特殊，食用方便，還含有多種有益于人體的營(yíng)養(yǎng)成分，自20世紀(jì)以來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)發(fā)酵香腸的研究便備受矚目，發(fā)酵劑種類日益更新，由單一的微生物發(fā)酵劑到復(fù)合發(fā)酵劑[8]。復(fù)配發(fā)酵劑是直投式發(fā)酵劑的一種，通過(guò)優(yōu)勢(shì)菌的作用，在不改變發(fā)酵品質(zhì)的基礎(chǔ)上，成功克服了微生物發(fā)酵劑的不足，從而改善了發(fā)酵劑的性能[9,10]。

雖然各種發(fā)酵劑菌株在發(fā)酵香腸中已有廣泛的應(yīng)用，但鮮有將魯氏酵母加入發(fā)酵香腸中，并研究其對(duì)發(fā)酵香腸中品質(zhì)影響的相關(guān)報(bào)道。因此，將魯氏酵母菌加入發(fā)酵香腸中，探究其是否能夠提高發(fā)酵香腸的風(fēng)味，是否具有增鮮增香的作用，將對(duì)魯氏酵母的開(kāi)發(fā)提供良好的基礎(chǔ)，為生產(chǎn)新型發(fā)酵食品提供依據(jù)。本研究通過(guò)菌種的耐酸性、耐食鹽能力、耐亞硝酸鹽能力、生長(zhǎng)溫度和最適生長(zhǎng)溫度等試驗(yàn)，對(duì)其發(fā)酵生產(chǎn)性能進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)，通過(guò)吲哚試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)，確定菌種的安全性能。判斷其是否符合應(yīng)用于發(fā)酵肉制品的要求，以便生產(chǎn)出新型發(fā)酵肉制品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)原料

YPD液體培養(yǎng)基、血瓊脂平板、蛋白胨水培養(yǎng)基、Kovacs氏靛基質(zhì)試劑盒、藥敏紙片(諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、阿莫西林、氨芐西林和鏈霉素)、氯化鈉(NaCl)、鹽酸(HCl)、氫氧化鈉(NaOH)、亞硝酸鈉(NaNO2)等常規(guī)化學(xué)試劑，均購(gòu)于大慶市博微生物試劑有限公司。

1.1.2 菌種來(lái)源

魯氏酵母菌(編號(hào)：32899)：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：均為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離純化菌種。

1.1.3 儀器設(shè)備

MET-TLERAE 100型分析天平 沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器公司； SW-CJ-1 FD型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；THZ-82 A型水浴恒溫振蕩器 金壇市榮華儀器制造有限公司；HZQ-QX型全溫振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TU-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 魯氏酵母的活化及培養(yǎng)

挑取魯氏酵母凍干粉進(jìn)行活化，將100 mL滅菌YPD液體培養(yǎng)基在無(wú)菌工作臺(tái)中倒入菌粉，放入全溫振蕩器中，28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)3天。將5 mL已活化的菌液加入100 mL培養(yǎng)基中，放入全溫振蕩培養(yǎng)箱中，28 ℃、180 r/min，培養(yǎng)30 h。

1.2.2 魯氏酵母的發(fā)酵生產(chǎn)性能研究

1.2.2.1 不同酸度對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)的影響

利用比濁法的原理，用光密度值(OD值)的變化來(lái)判斷菌株存活情況。根據(jù)朗伯比爾定律OD=logItIO=kbc，c表示樣品濃度，若樣品液厚度b一定，則OD值與樣品的濁度相關(guān)[11]。將活化好的菌種菌液以1%的接種比例，分別加入用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)pH值(3，4，5，6，7)的滅菌YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，將菌液稀釋至合適倍數(shù)(使吸光值在0.1～0.8之間)，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)量吸光度值，每組試驗(yàn)做3組平行。

1.2.2.2 不同食鹽濃度對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)的影響

將活化好的菌種菌液以1%的接種比例，加入不同鹽濃度(0，2%，4%，6%，8%，10%)的滅菌YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，測(cè)吸光度值，做3組平行試驗(yàn)。

1.2.2.3 不同亞硝酸鹽濃度對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)的影響

將活化好的菌種菌液以1%的接種比例，加入不同NaNO2濃度(0，50，100，150，200 mg/kg)的滅菌YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)量吸光度值，做3組平行試驗(yàn)。

1.2.2.4 不同溫度對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)的影響

將活化好的酵母菌懸液按一定量接種至YPD液體培養(yǎng)基中，置于25，28，30，35，40 ℃，于180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)量吸光度值，做3組平行試驗(yàn)。

1.2.3 魯氏酵母的安全性研究

1.2.3.1 吲哚試驗(yàn)

將3%活化好的魯氏酵母菌株接入到蛋白胨水培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)72 h，滴入吲哚3～4滴試劑，觀察試驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)用大腸桿菌做陽(yáng)性對(duì)照，并做空白試驗(yàn)。

1.2.3.2 溶血試驗(yàn)

將活化好的魯氏酵母菌株用接菌環(huán)劃線和穿刺于血瓊脂平板中，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察有無(wú)溶血圈出現(xiàn)。同時(shí)用金黃色葡萄球菌做陽(yáng)性對(duì)照，并做空白試驗(yàn)。

1.2.3.3 藥敏試驗(yàn)

分別吸取1 mL(約1×108cfu/mL)供試菌株菌液于15 mL YPD固體培養(yǎng)基(50 ℃)中，混勻后傾倒至滅菌培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，用無(wú)菌鑷子將藥敏紙片緊貼于瓊脂表面。室溫放置1 h，然后將平皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，24 h后測(cè)量并記錄抑菌圈直徑，每種抗生素做3組平行。分離菌株敏感性參照CLSI的最新版本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[12]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用Statistix 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用SigmaPlot 12.5進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 魯氏酵母菌生長(zhǎng)曲線

微生物的生長(zhǎng)曲線代表該微生物在新的環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖直至衰老死亡全過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化，一般分為遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)階段。魯氏酵母菌生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 魯氏酵母生長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Growth curve of Zygosaccharomyces rouxii

由圖1可知，在剛接種魯氏酵母時(shí)，測(cè)其吸光度值為0，說(shuō)明此時(shí)魯氏酵母還未生長(zhǎng)；在培養(yǎng)時(shí)間為0～48 h時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，測(cè)得的魯氏酵母的吸光度值越來(lái)越大，直到培養(yǎng)48 h時(shí)吸光度值最大；在培養(yǎng)36～72 h時(shí)，吸光度值在0.6～0.9，而此時(shí)的生長(zhǎng)曲線呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，說(shuō)明魯氏酵母菌在此時(shí)生長(zhǎng)最旺盛。

2.2 魯氏酵母的發(fā)酵生產(chǎn)性能研究

2.2.1 不同酸度對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)的影響

酵母菌通常與乳酸菌復(fù)配成復(fù)合發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵肉制品中，因此酵母菌必須適應(yīng)乳酸菌所造成的酸性環(huán)境[13]。在發(fā)酵過(guò)程中，pH在4.8～5.0時(shí)對(duì)致病菌及腐敗菌的抑制效果最好，可加快發(fā)酵香腸色澤、風(fēng)味的形成，減少蛋白質(zhì)的束水能力以保證干燥，因此，需測(cè)定魯氏酵母在不同pH下的生長(zhǎng)情況。

圖2 不同酸度對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of different acidity on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

由圖2可知，魯氏酵母菌在pH為3時(shí)仍能較好存活；在pH為4～6的酸性環(huán)境中生長(zhǎng)良好，在此期間，隨著pH的增加，生長(zhǎng)越來(lái)越旺盛。故而說(shuō)明魯氏酵母菌能夠在酸性環(huán)境下穩(wěn)定生長(zhǎng)，符合作為發(fā)酵劑的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.2 不同食鹽濃度對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)的影響

相關(guān)資料顯示，腌制發(fā)酵香腸時(shí)，通常添加2%左右的食鹽，但隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，香腸內(nèi)部水分含量會(huì)逐漸減少，食鹽濃度會(huì)逐步升高，在一般的發(fā)酵香腸中，食鹽含量可達(dá)到5%。因此，欲將魯氏酵母菌作為發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵香腸中，必將考慮其對(duì)食鹽的耐受能力，本試驗(yàn)測(cè)定魯氏酵母菌的最大食鹽耐受濃度為6%。

圖3 不同食鹽濃度對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of different salt concentration on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

由圖3可知，添加食鹽濃度對(duì)魯氏酵母菌的生長(zhǎng)影響較大，食鹽濃度越高，抑制越明顯。在食鹽濃度為2%時(shí)，魯氏酵母的生長(zhǎng)未發(fā)生明顯變化；當(dāng)食鹽濃度為4%～6%時(shí)，吸光度值有緩慢降低趨勢(shì)，但仍處于良好狀態(tài)；食鹽濃度達(dá)到8%時(shí)，吸光度值下降明顯，魯氏酵母菌的生長(zhǎng)趨于緩慢。因此，魯氏酵母菌能夠耐受6%的食鹽濃度，就此項(xiàng)指標(biāo)而言，其可作為發(fā)酵劑使用。

2.2.3 不同亞硝酸鹽濃度對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)的影響

亞硝酸鹽作為重要的食品添加劑，對(duì)發(fā)酵香腸的生產(chǎn)有著密不可分的作用。在香腸的發(fā)酵過(guò)程中，利于顏色和腌臘制品特殊風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)的產(chǎn)生；對(duì)于在肉制品中危害較大的致病菌有顯著抑制其生長(zhǎng)繁殖的作用[14-17]，確保產(chǎn)品的生物安全性。對(duì)于食品中亞硝酸鹽的添加量我國(guó)有著嚴(yán)格的規(guī)定，不得超過(guò)30 mg/kg；而用來(lái)生產(chǎn)肉品發(fā)酵劑的微生物一般要求可耐受100 mg/kg的亞硝酸鹽濃度，因此本試驗(yàn)測(cè)定的最大亞硝酸鹽濃度為200 mg/kg。

圖4 不同亞硝酸鹽濃度對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of different nitrite concentration on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

由圖4可知，隨著亞硝酸鹽濃度的增加，魯氏酵母菌的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制。當(dāng)亞硝酸鹽濃度為0.005%時(shí)，魯氏酵母菌的吸光度值驟然下降，生長(zhǎng)速度明顯遲緩；亞硝酸鹽濃度達(dá)到0.015%時(shí)，魯氏酵母菌仍保持一定程度的生長(zhǎng)；當(dāng)亞硝酸鹽濃度升高至0.020%時(shí)，吸光度值明顯小于0.6，處于生長(zhǎng)滯緩階段。由此說(shuō)明，魯氏酵母菌具有較高的耐受亞硝酸鹽能力，可作為發(fā)酵香腸的發(fā)酵劑使用。

2.2.4 不同溫度對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)的影響

發(fā)酵香腸的發(fā)酵溫度通常為25～28 ℃，為了保證作為發(fā)酵劑的酵母菌能夠在生產(chǎn)條件下良好生長(zhǎng)，菌株的最佳生長(zhǎng)溫度須符合此溫度范圍。

圖5 不同溫度對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of different temperatures on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

由圖5可知，魯氏酵母菌在25 ℃時(shí)生長(zhǎng)處于旺盛階段；在28 ℃時(shí)生長(zhǎng)最旺盛，此后隨溫度升高，吸光度值降低，生長(zhǎng)緩慢，35 ℃時(shí)生長(zhǎng)遲緩，由此可見(jiàn)，魯氏酵母菌在25～32 ℃之間生長(zhǎng)旺盛，最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，符合作為發(fā)酵劑的要求。

2.3 魯氏酵母的安全性研究

2.3.1 吲哚試驗(yàn)

吲哚試驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)菌株能否分解到蛋白質(zhì)中的色氨酸。色氨酸是人體內(nèi)的必需氨基酸之一，可以參與人體內(nèi)蛋白質(zhì)合成，調(diào)節(jié)免疫功能，具有促進(jìn)消化吸收的作用[18]。如果待測(cè)菌株吲哚試驗(yàn)呈陽(yáng)性，則說(shuō)明該菌株能分解色氨酸，從而引起人體代謝障礙。

圖6 魯氏酵母菌吲哚試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of indole test of Zygosaccharomyces rouxii

注：1為未添加菌種；2～4為添加魯氏酵母；5為添加大腸桿菌。

向培養(yǎng)好的菌液中滴加指示劑后，空白對(duì)照組與魯氏酵母菌的3組平行試驗(yàn)均未出現(xiàn)紅色圓環(huán)，而大腸桿菌中出現(xiàn)紅色圓環(huán)，由圖6可知，魯氏酵母菌的吲哚試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，大腸桿菌的吲哚試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性。吲哚試驗(yàn)結(jié)果表明，魯氏酵母菌不會(huì)分解色氨酸產(chǎn)生吲哚類物質(zhì)。

2.3.2 溶血試驗(yàn)

溶血是指紅細(xì)胞破裂溶解現(xiàn)象，可由多種理化因素和毒素引起[19]。如果發(fā)酵食品所用微生物具有溶血現(xiàn)象，會(huì)對(duì)人體造成一定危害，因此有必要在使用前對(duì)其進(jìn)行溶血試驗(yàn)。

圖7 魯氏酵母菌溶血試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 The results of hemolytic test of Zygosaccharomyces rouxii

注：1為未接種菌種；2～4為接種魯氏酵母菌；5左側(cè)為接種魯氏酵母菌，右側(cè)為接種金黃色葡萄球菌。

由圖7可知，在培養(yǎng)的魯氏酵母菌周圍的瓊脂未顯示綠色，同時(shí)并未出現(xiàn)透明圈，說(shuō)明沒(méi)有產(chǎn)生α-溶血和β-溶血現(xiàn)象，而金黃色葡萄球菌周圍則顯示透明溶血圈；實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本試驗(yàn)所用的魯氏酵母菌無(wú)溶血現(xiàn)象發(fā)生，說(shuō)明菌株不是溶血細(xì)菌，具有食用安全性。

2.3.3 藥敏試驗(yàn)

采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定了魯氏酵母菌對(duì)7種抗生素的抗藥性情況，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。菌株對(duì)抗生素產(chǎn)生的抑菌圈直徑均在質(zhì)控范圍內(nèi)，因此，試驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)為真實(shí)結(jié)果。

表1 魯氏酵母菌的抑菌圈直徑及抗性結(jié)果Table 1 Diameter of bacteriostatic circle and antibiotic resistance results of Zygosaccharomyces rouxii

注：抑菌圈直徑以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示；供試菌株對(duì)某種抗生素敏感(susceptible)用S表示，中度敏感(intermediate)用I表示，抗性(resistant)用R表示。

由表1可知，魯氏酵母菌對(duì)紅霉素(大環(huán)內(nèi)酯類藥物)、氨芐西林(青霉素類藥物)、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星(喹諾酮類藥物)以及鏈霉素(氨基糖苷類藥物)敏感，對(duì)阿莫西林有抗性，說(shuō)明魯氏酵母可安全用于肉品發(fā)酵劑。

3 結(jié)論

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于發(fā)酵肉制品的研究始終都是熱門，關(guān)于各種微生物菌群的開(kāi)發(fā)及綜合使用等相關(guān)研究更是層出不窮。國(guó)內(nèi)的眾多研究者研究微生物發(fā)酵劑時(shí)，大多關(guān)注于細(xì)菌的相關(guān)研究，如乳酸菌、微球菌、葡萄球菌等，也有些研究者將具有改善發(fā)酵肉制品風(fēng)味及促進(jìn)顏色等作用的酵母菌定為研究方向，將其配合乳酸菌等微生物作為發(fā)酵劑使用。

本研究通過(guò)菌種的耐酸性、耐食鹽能力、耐亞硝酸鹽能力、生長(zhǎng)溫度和最適生長(zhǎng)溫度等試驗(yàn)，對(duì)其發(fā)酵生產(chǎn)性能進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)，通過(guò)吲哚試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)，確定菌種的安全性能，判斷其是否符合應(yīng)用于發(fā)酵肉制品的要求。試驗(yàn)結(jié)果顯示，魯氏酵母菌在pH為4～6的培養(yǎng)條件下可良好生長(zhǎng)；耐受6%的食鹽濃度和150 mg/kg的亞硝酸鹽；在25～32 ℃均能較好生長(zhǎng)，在28 ℃生長(zhǎng)情況最佳；在培養(yǎng)過(guò)程中，魯氏酵母菌不會(huì)產(chǎn)生吲哚類物質(zhì)，亦不屬于溶血細(xì)菌；對(duì)紅霉素、氨芐西林、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星以及鏈霉素敏感，對(duì)阿莫西林有抗性。綜上所述，魯氏酵母菌的各項(xiàng)生產(chǎn)安全性能符合作為發(fā)酵肉制品的要求，可考慮與乳酸菌復(fù)配成復(fù)合發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵香腸或其他發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)，起到穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)品品質(zhì)的作用。