康普瑞汀磷酸鈉對U87細胞增殖和遷移的影響以及信號通路研究

郭曼嵐，劉蔚雯，勾夢壯，劉亞偉，陳騰祥

1貴州醫科大學基礎醫學院生理學教研室//貴州省干細胞重點實驗室，貴州 貴陽 550009；南方醫科大學2第一臨床醫學院，3南方醫院神經外科//精準神經外科實驗室，廣東 廣州 510515

膠質瘤是成人中最常見的原發性腦腫瘤，平均無進展生存期僅6月[1-2]，表現出惡性侵襲性和不良預后[3]。手術聯合治療和化療是治療原發性膠質瘤的主要治療方法[4]。目前，替莫唑胺（TMZ）是用作神經膠質瘤治療的一線治療藥物，但轉移性膠質瘤治療方面進展甚微，主要是由于癌細胞對化療的抵抗[5-7]。因此，尋找一種新的藥物是迫切需要的。康普瑞汀磷酸鈉（CA4P）是一種微管蛋白結合的腫瘤血管破壞劑，對腫瘤血管系統顯示有效和選擇性毒性[8-9]。CA4P已經過廣泛臨床試驗，且在使用多種模式的臨床前研究中進行了評估[10-11]，對多種惡性腫瘤具有抑制作用。有文獻報道，CA4P引起快速，暫時的腫瘤血管關閉，并導致大鼠腦腫瘤異種移植物中的腫瘤灌注減少[12]。在體外，CA4P增加臍帶靜脈內皮細胞通透性，同時主要通過破壞VE-鈣粘蛋白/β-連環蛋白/Akt信號傳導途徑來抑制內皮細胞遷移和毛細血管形成，從而導致快速血管崩解和腫瘤壞死[13]。同時，CA4P能夠體外抑制人早幼粒細胞，人非小細胞肺癌細胞，人肝癌細和，人宮頸癌細胞等的增值活性和影響人晶狀體上皮細胞增殖及遷移[14-16]。但是，對于CA4P作用膠質瘤的體外研究很少。本研究將CA4P應用于體外培養的人腦星形膠質母細胞瘤細胞U87，表明CA4P的抗腫瘤作用主要是通過抑制增值和遷移，可為臨床化療用藥提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人膠質瘤U87細胞購買自ATCC細胞庫。CA4P購自上海蒽桂生物科技有限公司，溶于二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）配制成10 mmoL/L保存液。DMEM，0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco，胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自美國Hyclone。CCK-8試劑盒購自日本，DAPI購自美國ROCHE。E-Cadherin、GAPDH兔一抗和兔二抗、Path Scan Intracellular Signaling Array Kit購自于Cell Signaling Technology。

1.2 細胞培養

人膠質瘤U87細胞常規復蘇后，貼壁培養在含10% FBS、100 U/L青霉素和鏈霉素的DMEM細胞培養基中，放置在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。培養3 d消化傳代，取對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.3 CCK-8細胞活力檢測

取對數生長期的細胞消化鋪于96孔板中，5×103/孔。12 h后，分別用0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L CA4P刺激細胞。設置3個復孔，在分別刺激1、2、3、4、5 d后，吸棄原細胞上清，每孔加入110 μL（含10 μL cck-8試劑）培養基，在培養箱中孵育2 h，用酶標儀測定450 nmol/L處的A值。得到的數值用SPSS 22.0統計并用graphpad軟件得到折線圖。

1.4 劃痕和transwell遷移實驗

取對數生長期的細胞消化鋪于6孔板中，3×105/孔，12 h后，用20 μL的槍頭在單層細胞上沿垂直方向呈“一”字劃痕，用PBS洗掉漂浮的細胞后，加入無血清的DMEM培養基（分別含0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L CA4P），培養24 h后用倒置顯微鏡下拍攝3個劃痕區域。細胞消化鋪105個于transwell小室中，上室為DMEM，下室含10%FBS的DMEM，12 h后細胞用甲醇固定5 min，晾干，DAPI染5 min，熒光顯微鏡下取6個視野拍照。

1.5 Western blot及pathscan檢測

將U87細胞鋪于10 cm培養皿，分別用0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L CA4P刺激24 h后，收集細胞總蛋白。用BCA法測定蛋白的濃度，制備10%SDSPAGE凝膠，電泳，轉膜，封閉后4℃孵育一抗過夜。TBST洗3遍，室溫孵育二抗1 h，TBST洗3遍，發光液進行顯影。使用Path Scan Intracellular Signaling Array Kit試劑盒檢測細胞信號通路。取對數生長期的U87細胞鋪于10 cm細胞培養皿中，分別給予0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L的CA4P刺激24 h，按照Path Scan Intracellular Signaling Array Kit試劑盒說明書進行蛋白提取，孵育，于Kodak Image Station 2000MM成像系統進行顯影。

1.6 統計分析

用Image J軟件測量灰度值，所有的數據用SPSS 22.0軟件進行兩個獨立樣本t檢驗分析，P＜0.05為差異具有統計學意義，統計圖和折線圖用Excel軟件。

2 結果

2.1 CA4P抑制U87細胞增殖

CA4P作用U87細胞24內，各組間U87細胞活力差異不具有統計學意義（P＞0.05）。24 h后，與對照組相比6.25、12.5、25、50、100 nmol/L的CA4P可以使細胞存活率降低（圖1）。

圖1 CA4P抑制U87細胞的增殖

2.2 CA4P抑制U87細胞遷移

細胞劃痕實驗表明CA4P作用U87細胞24 h后，各濃度組都能抑制細胞的遷移。其中，濃度為50、100 nmol/L時抑制最為顯著（圖2A）。Transwell實驗同樣表明，CA4P對U87細胞遷移能力的抑制作用并且具有濃度依賴性。CA4P隨著作用濃度的增加抑制作用逐漸增加，10 nmol/CA4P作用U87細胞24 h后可以顯著抑制細胞從上室穿過到下室（P＜0.001，圖2B、C）。

圖2 CA4P抑制U87細胞的遷移

2.3 CA4P使得U87細胞中E-Cadherin上調和通路激活

Western blot結果顯示，不同濃度的CA4P作用細胞后，EMT標記蛋白E-Cadherin的相對表達水平隨著CA4P濃度的增加逐漸升高，呈濃度依賴性（圖3A）。Pathscan實驗證明，不同濃度CA4P刺激后與對照組相比Akt的Ser473位點磷酸化水平升高，但是濃度為100 nmol/L時磷酸化水平降低。Bad在Ser112位點磷酸化水平升高，但是濃度為100 nmol/L時磷酸化水平沒有顯著改變，50 nmol/LCA4P使得細胞中SAPK/JNK在THR183/TYR18位5和GSK-3β在SER9位磷酸化水平升高，而其它濃度刺激沒有顯著改變。S6 ribosomal protein的Ser235/236位點磷酸化水平降低，但是濃度為50 nmol/L時磷酸化沒有顯著變化（圖3B）。

圖3 不同濃度的CA4P作用U87細胞后E-Cadherin蛋白和細胞內信號通路的變化

3 討論

迄今為止，膠質瘤研究在基因分析水平取得了巨大進步。分子靶向藥物治療的Ⅲ期臨床試驗卻均告失敗，包括貝伐單抗也不能使患者明顯獲益。另外，由于膠質瘤免疫原性不強，因此對某些腫瘤療效顯著的免疫療法如疫苗、抗體、嵌合抗原受體-T細胞治療都沒有明顯進展。CA4P作為一個在臨床研究中發現由于破壞血管而具有抗腫瘤活性作用的藥物，對膠質瘤治療的突破存在潛在的可能性。所以，CA4P對抗膠質瘤作用的機制探討的研究可以為CA4P對于膠質瘤臨床研究提供理論基礎。

癌發生是一個多步驟的過程，其中組織結構的變化和腫瘤前結節的形成先于癌癥的出現[17]。這些改變與細胞表型的改變有關，包括上皮細胞間質轉化和細胞遷移，導致局部缺氧區域促進組織干細胞的存活和生長[18]以及血管生成，從而使得癌細胞不受控制的生長。缺乏正常的生長控制不僅在腫瘤早期發生而且在腫瘤轉移過程中起作用。因此，有許多研究需要研究如何以及何時開始異常生長，然后利用這些知識來確定新的治療靶點和方法。在以往的報道中，研究者發現CA4P可以抑制體外和體內很多癌癥的活性[14-16]。但是，對于膠質瘤，只報道過CA4P減少大鼠腦腫瘤的皮下移植瘤的血管灌注。CA4P作用膠質瘤的體外研究很少。本研究的目標是了解CA4P對膠質瘤U87細胞的作用，結果發現CA4P抑制U87細胞的增殖和遷移，U87細胞的遷移率隨著CA4P作用濃度的增加而下降，呈現濃度效應。此外，隨著CA4P濃度的增加，細胞中E-Cadherin水平上調。許多的研究同樣證明E-Cadherin蛋白與細胞遷移有關。例如，有研究認為原鈣粘蛋白7可以通過抑制E-Cadherin抑制細胞遷移[19]，也有研究認為在前列腺癌中E-Cadherin蛋白表達上調抑制了細胞遷移[20]。

有關CA4P抑制細胞增殖的機制有各種報道。CA4P破壞線粒體膜電位，釋放促凋亡的線粒體膜蛋白和DNA片段化使得急性骨髓性白血病線粒體損傷。此外，CA4P通過下調粘附分子VCAM-1的表達來減少白血病細胞與新生血管的相互作用，從而增加白血病細胞死亡[21]。CA4P引起DNA片段化的G2/M周期阻滯，誘導凋亡和自噬標記微管相關蛋白質輕鏈3-II蛋白水平上調介導人臍靜脈內皮細胞程序性死亡。研究發現犬腫瘤組織來源的內皮細胞中VE-cadherin的表達模式異常，VE-cadherin異常表達增加了細胞對CA4P的敏感性[22]。

本研究通過實驗發現CA4P抑制細胞增殖和遷移與細胞信號通路變化有關。CAP4刺激后S6 ribosomal protein的Ser235/236位點磷酸化水平降低。S6 ribosomal protein的下調顯著的抑制體外細胞的增殖，促進細胞在G0-G1期阻滯[23]。Akt磷酸化抑制Ser112處的促凋亡蛋白Bad和Ser9處的多功能激酶GSK-3β活性并促進細胞存活[24-26]。JNK被歸類為應激激活的激酶，并被各種應激物激活，包括氧化應激和化療藥物。已發現JNK調節促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，其在線粒體依賴性細胞凋亡中發揮關鍵作用[27]。Path Scan實驗研究發現用濃度為6.25、12.5、25、50 nmol/L的CA4P作用24 h，Akt上調，加大濃度為100 nmol/L時下調。以前已經證實在人類癌癥中Akt磷酸化位點激活促進癌癥的發生發展[24，28]。但是，本研究在Path Scan實驗研究發現濃度為66.25、12.5、25、50 nmol/L的CA4P作用24 h，Akt上調，加大濃度為100 nmol/L時下調。這可能是CA4P介導信號通路間的互相調節，從而表現出不同劑量，主導細胞功能的信號通不同。

總之，CA4P抑制U87細胞的增殖和遷移和調控相關信號通路。某個信號通路的變化或者幾個信號通路間相互影響調節膠質瘤細胞增殖和遷移的機制是一個復雜的過程，需要進一步深入探究。