維替泊芬抑制腎癌細胞769-P增殖及其機制

劉國欽，胡國強，冼玉榮，曾貴林，李姝君

1江門市新會區人民醫院腎內內分泌科，廣東 江門 529100；2江門市中心醫院腎內科，廣東 江門 529100；3廣東醫科大學附屬醫院腫瘤一區，廣東 湛江 524000

腎細胞癌（腎癌），男性患者多于女性患者，屬于泌尿生殖系統中的高發惡性腫瘤[1-2]。近年來，伴隨著環境因素的變化以及國民生活方式的改變，腎癌的發病率逐年上升[3-4]。目前針對腎癌的治療方案主要為手術切除療法，但是切除術后出現腎癌復發或者轉移仍然為治療的一大難題。化療、放療為惡性腫瘤的重要治療方案，結合外科手術切除治療取得良好的療效。由于腎癌細胞中常常表達多藥耐藥基因（MRD），編碼多藥耐藥蛋白并錨定于細胞膜表面，具有藥物泵的作用，可加速將進入腎癌細胞中的藥物泵出細胞外而使化療藥物失去療效[5-7]。相對于其它惡性腫瘤而言，腎細胞癌對化療和放療敏感性弱，預后不良[8-9]。維替泊芬于2000年獲得批準應用于臨床治療的一種光學增強劑，主要治療以脈絡膜血管形成為主的老年黃斑相關疾病。近年來，多篇文獻報道維替泊芬具有抑制多種腫瘤細胞生存的能力，包括肝癌、甲狀腺癌及血液系統惡性疾病等[10-17]。維替泊芬通過調控相關細胞通路及基因的表達，作用于癌細胞的基因復制、轉錄及翻譯水平，促進腫瘤細胞凋亡并抑制其生長。截至目前為止，未見研究報道關于維替泊芬對腎細胞癌的作用。本文通過探究維替泊芬對腎細胞癌的殺傷作用，進一步研究該藥物殺傷腎細胞癌的潛在機制，為開發腎癌治療新藥物及新治療靶點奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

769-P細胞來源于ATCC。維替泊芬（Verteporfin，純度≥98%）購自Selleckchem。RPMI-1640培養基、PBS緩沖液、0.25%胰酶、胎牛血清均購自BI。細胞增殖檢測試劑盒（CCK8）購自Dojindo。免疫印跡實驗的所有抗體均購自CST。熒光定量PCR及逆轉錄試劑盒均購自Takara。實時熒光定量PCR引物由廣州艾基生物技術有限公司提供合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 769-P細胞以普通完全培養基（含10% FBS的1640）于孵箱中培養。細胞增殖至培養皿的75%～85%時，消化并傳代培養。

1.2.2 維替泊芬藥物溶液配制 維替泊芬用二甲基亞砜充分溶解，配成濃度為100 μmol/L的母液，保存于超低溫冰箱中。實驗前用PBS緩沖液將維替泊芬母液配成不同濃度的工作液備用。

1.2.3 維替泊芬半數抑制濃度測定 取狀態良好的769-P細胞以5000/孔接種于96孔板中，24 h后按照實驗需求將培養基更換為含維替泊芬的培養液，濃度分別為0、0.1、0.5、1、5、10、20 μmol/L，每個濃度4復孔。完全培養基組為空白組，0 μmol/L組為對照組。加藥處理48 h后按照CCK8說明書指示進行操作，利用全波長酶標儀檢測A450nm。抑制率=100%-（實驗組-空白組）/（對照組-空白組）×100%。

1.2.4 細胞增殖實驗 769-P細胞以2000/孔接種于96孔板中，24 h后按照實驗設計將培養基更換為含維替泊芬的培養液。利用CCK8分別檢測加藥后第0、24、48、72 h的細胞活性，計算并繪制生長曲線。

1.2.5 細胞凋亡及周期實驗 769-P細胞以5×105/孔接種于6孔板中，24 h后按照實驗設計將培養基更換為含維替泊芬的培養液，藥物濃度依次為0、1、5、10 μmol/L，細胞于孵箱中繼續培養24 h后用按照APC/PI凋亡試劑盒和BD公司的周期試劑盒說明書指示進行細胞處理，流式細胞儀進行后續細胞凋亡和細胞周期的檢測。

1.2.6 劃痕實驗 狀態良好的769-P細胞以1×106/孔的密度接種于6孔板中，待細胞增殖至密度達90%～100%時，用無菌的中槍頭在細胞中迅速劃痕，更換相應藥物濃度的培養基，加藥濃度依次為0、1、5、10 μmol/L加藥前于倒置顯微鏡下拍照，培養48 h后再拍照1次。

1.2.7 克隆實驗 腎癌769-P細胞以1000/孔的密度接種于6孔板中，24 h后按照實驗設計將培養基更換為含維替泊芬的培養液，藥物濃度分別為0、1、5、10 μmol/L，細胞培養10 d后用PBS緩沖液沖洗干凈，固定液固定0.5 h，繼續沖洗后加入結晶紫染色0.5 h，沖洗干凈染色液后拍照。細胞克隆為超過50個細胞的細胞團。

1.2.8 實時熒光定量PCR 用TRIzol裂解細胞并提取總RNA。嚴格按照逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR說明書（TaKaRa）指示進行細胞總RNA的逆轉錄及熒光定量檢測。實時熒光定量PCR引物序列見表1。內參基因選用GAPDH，利用2-ΔΔCt法分析結果。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.9 Western blotting 收集各組細胞并洗滌干凈，加入適量的強效細胞裂解液并充分吹打混勻，放置于冰上裂解0.5 h。低溫離心機中12 000 r/min離心12 min后收集上清液。BCA蛋白定量法檢測各實驗組細胞裂解液中的蛋白濃度，加入適量的蛋白上樣緩沖液并充分混勻，100 ℃雙蒸水中煮 8min后將樣品保存于超低溫冰箱中。SDS-PAGE電泳：預先制備好SDSPAGE凝膠，每個電泳通道的上樣蛋白量為35 μg，恒壓80 V電泳20 min后切換到110 V電泳約70 min；利用250 mA恒流濕轉法將SDS-PAGE凝膠上的蛋白轉印到標記好的PVDF膜上；5%BSA溶液封閉約70 min后孵育相應一抗溶液，低溫搖床上搖晃孵育一抗過夜；TBST洗滌一抗5次，總共0.5 h；室溫下孵育二抗約70 min；TBST洗脫二抗4次，總共2 0min；加入預先配制的ECL發光液并放置于Tannon成像系統中，顯色，拍照。

1.2.10 統計學方法 計數資料及計量資料均采用雙側檢驗，參數檢驗采用t檢驗而非參數檢驗采用χ2檢驗，P＜0.05認為差異具有統計學意義。數據采用GraphPadPrism 7軟件處理。

2 結果

2.1 維替泊芬對腎癌細胞769-P形態及生長的影響

維替泊芬對769-P細胞的半數抑制濃度為4.917 μmol/L。2 μmol/L的維替泊芬作用于769-P細胞24 h后即能改變細胞形態，抑制細胞生長。

2.2 維替泊芬抑制769-P細胞增殖

CCK8實驗結果顯示，隨著維替泊芬濃度的升高以及作用時間的延長，細胞增殖速率變慢，說明維替泊芬抑制腎癌769-P細胞增殖具有濃度依賴性和時間依賴性（P＜0.05，圖1A-B）。

2.3 維替泊芬促進腎癌769-P細胞凋亡并阻滯769-P細胞生長周期

流式細胞術結果顯示隨著維替泊芬濃度的增大，769-P細胞凋亡率越高。各濃度維替泊芬處理后769-P細胞G0/G1期比例增加，S期及G2/M期比例均比對照組細胞少（P＜0.05，圖1C-D）。

2.4 維替泊芬抑制769-P細胞遷移

細胞劃痕實驗顯示，隨著維替泊芬濃度的增大，細胞遷移距離變小，說明維替泊芬抑制腎癌細胞遷移的能力（P＜0.05，圖2A-H）。

圖1 維替泊芬對769-P細胞增殖、凋亡及周期的影響

圖2 細胞劃痕實驗

2.5 克隆實驗

空白對照組明顯可見細胞克隆形成，1 μmol/L維替泊芬處理組細胞克隆形成數目略少于正常對照組，5 μmol/L維替泊芬處理組細胞克隆較少，10 μmol/L維替泊芬處理組基本未見細胞克隆形成（P＜0.05，圖3）。

圖3 不同濃度維替泊芬對對769-P細胞克隆形成能力的影響

2.6 實時熒光定量PCR

維替泊芬作用于腎癌769-P細胞后降低Bcl-2基因、YAP基因、TEAD基因及CyclinD1基因表達量，Bax基因、CDK4基因及Caspase-3基因的表達量上升（P＜0.05，圖4A）。

2.7 Western blotting

維替泊芬作用于腎癌769-P細胞后降低Bcl-2蛋白、YAP蛋白、TEAD蛋白及CyclinD1蛋白表達量，Bax蛋白、CDK4蛋白及Caspase-3蛋白的表達量增加（P＜0.05，圖4B）。

圖4 維替泊芬對相關基因及蛋白表達的影響

3 討論

目前，腎細胞癌的發生率逐年升提高，其發病率在泌尿生殖系統惡性腫瘤中排行第2位，僅次于膀胱癌，并且部分病人在初診時已經出現癌細胞轉移。目前腎癌的主要治療方法為外科治療，由于腎癌對放療和化療敏感性弱，促使科研工作者們致力于研究并探尋新的治療腎癌藥物[1-2]。維替泊芬是一種用于治療老年黃斑相關疾病的光學增強劑，近年來多項研究發現維替泊芬可調節腫瘤相關基因及細胞信號通路從而抑制多種癌細胞增殖，具有治療肝癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌及白血病等多種惡性腫瘤[10-17]。

本研究發現維替泊芬具有抑制腎癌769-P細胞增殖能力，并且抑制效率呈濃度依賴性。維替泊芬具有抑制腎癌細胞遷移及侵襲的能力。流式細胞術檢測結果發現加大維替泊芬濃度，腎癌769-P細胞凋亡率呈濃度依賴性上升。熒光定量PCR及免疫印跡實驗結果顯示，維替泊芬作用于腎癌769-P細胞后導致Bcl-2的表達量降低，而Bax表達量增加，最終提升Bax/Bcl-2比率，激活caspase-3并增加其表達量。Bcl-2是一種抑制凋亡分子而Bax是一種促進凋亡的分子，兩者都是重要的凋亡通路調節分子[18-19]。Caspase-3是一種剪切酶，在激活凋亡通路中發揮著非同凡響的作用。當細胞處于靜息狀態時，caspase-3以酶原形式定位于胞質中，處于一種非激活的狀態。細胞凋亡信號通路一旦被激活，細胞質中的多種蛋白水解酶將對caspase-3進行裂解，使得caspase-3進一步活化[20]。維替泊芬通過Bax/Bcl-2誘導胰腺癌細胞凋亡，Bax/Bcl-2比例升高可活化PARP、caspase激酶活性，誘導腫瘤細胞凋亡的發生[21]。我們的研究結果同樣顯示維替泊芬可調節Bax/Bcl-2及caspase-3促進腎癌769-P細胞凋亡。

此外，本研究發現維替泊芬影響腎癌細胞生長周期，能將769-P細胞阻滯于G0/G1期，S期和G2/M期比例減少，抑制細胞增殖。熒光定量PCR及免疫印跡實驗結果顯示，經維替泊芬藥物處理后腎癌769-P細胞的YAP、TEAD和CyclinD1蛋白表達量減少。研究發現在慢性粒細胞中，維替泊芬作用于癌細胞后可減少YAP及TEAD蛋白的表達，抑制YAP及TEAD蛋白的相互作用，進一步降低CyclinD1蛋白水平，阻滯癌細胞生長周期于G0/G1期，減少處于S期細胞數，降低癌細胞增殖率[22]。細胞周期蛋白依賴性激酶4簡稱CDK4，可促進細胞從G1期向S期轉化[23]，本研究發現維替泊芬可同時減少腎癌細胞的CyclinD1和CDK4表達量，抑制769-P細胞生長周期于G0/G1期，減少腎癌細胞的DNA合成量，進而抑制腎癌細胞生存能力。

綜上所述，我們首次發現維替泊芬可抑制腎癌769-P細胞的生存、遷移及侵襲能力，阻滯癌細胞生長周期并促進細胞凋亡，為腎癌的治療提供新方向及新選擇。