光譜法及分子模擬研究青蒿素與小牛胸腺DNA的相互作用

金麗虹 ， 王夢欣, 周雅靜, 朱海煥, 劉美慧, 張善凱, 顧錫輝, 申炳俊*

(1. 長春理工大學 生命科學技術學院， 吉林 長春 130022； 2. 河南科技學院新科學院 生物與化學工程系， 河南 新鄉 453003)

1 引 言

青蒿素(Artemisinin,簡稱QHS)是一種具有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，為植物黃花蒿(A.annuaL.)抗瘧的有效成分。20世紀70年代，中國科學家首次分離得到青蒿素并解析了其化學結構，作為最有效的抗瘧藥物青蒿素受到了全世界高度關注[1-2]。隨著青蒿素研究的不斷深入，人們發現，除了具有抗瘧活性外，青蒿素還在抗血吸蟲[3]、抗內毒素[4]、抗變態反應[5]、抗紅斑狼瘡[6]、增強機體免疫[7]等方面也有藥理作用。同時，青蒿素在治療腫瘤和艾滋病方面展現出了誘人的應用前景[8-9]。2015年，屠呦呦研究員因發現青蒿素而獲得諾貝爾生理學或醫學獎[10]，這使得有關青蒿素的研究再次成為熱點。全世界的學者們發表了大量與青蒿素有關的研究論文，其內容涉及瘧原蟲抗藥性、抗瘧和抗癌作用機制、作用靶點理論、生物活性及代謝調控等。然而令人遺憾的是，青蒿素抗瘧和抗癌的具體分子機制至今尚未完全闡明。

DNA是所有生命活動的基礎，也是一些藥物最主要的作用靶點。藥物小分子與DNA的相互作用能不同程度影響DNA的生理和物理化學性質，改變DNA的轉錄和復制，進而表現出抗病毒、抗腫瘤活性[11]。小分子物質與DNA的相互作用主要有3種模式：溝槽作用、嵌入作用和靜電作用，其中具有選擇性的溝槽和嵌插作用是藥物分子和DNA相互作用研究的重點[12-13]。因此，在分子水平研究藥物與DNA的相互作用機理，這對于了解藥物藥理活性、毒性以及預測藥物相互作用等方面具有重要意義。已有文獻表明，青蒿素可以嵌插到DNA分子中，兩者間能形成QHS-DNA復合物[14]。但青蒿素嵌插到DNA的位置、非共價作用方式以及熱力學參數等信息仍需要進一步研究。

基于此，本文采用吸收光譜、熒光光譜、共振散射光譜以及分子模擬等技術研究了青蒿素與DNA的相互作用模式、結合距離、分子間作用力、最佳作用位點等信息。實驗結果為進一步揭示青蒿素抗瘧、抗癌作用機理提供了依據。

2 實 驗

2.1 材料與儀器

小牛胸腺DNA購買于Sigma公司，用pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液配成ctDNA儲備液。青蒿素購買于成都普菲德公司，貯液用無水乙醇溶解配成。溴化乙錠(EB)購買于Sigma公司，用二次蒸餾水溶解配成儲備液。上述儲備液均置于4 ℃冰箱中保存。

測試儀器包括:UV-2550紫外-可見分光光度計(日本島津公司)，F-280熒光分光光度計(中國天津港東公司)，DELTA320型pH計(瑞士Mettler Toledo公司)，DC-4006高精度恒溫水浴(上海菁海儀器公司)。

2.2 實驗方法

2.2.1 紫外吸收光譜

于7 mL比色管中依次加入1 mL的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4)、200 μL 4.5×10-4mol/L DNA儲備液和不同體積的1.0×10-4mol/L青蒿素溶液，Tris-HCl緩沖溶液定容至4 mL，充分混合后于室溫下作用30 min。以相應濃度的青蒿素Tris-HCl溶液為參比，掃描205～345 nm范圍內QHS-DNA體系吸收光譜。Tris-HCl緩沖液作為參比，獲得2.0×10-5mol/L 青蒿素Tris-HCl溶液吸收光譜。

2.2.2 熒光光譜

7個比色管中均加入1 mL Tris-HCl緩沖溶液、100 μL 4.5×10-4mol/L DNA儲備液和180 μL 3.0×10-5mol/L EB溶液，充分混合于恒溫水浴(298，304 K)中作用30 min。然后向每個EB-DNA體系中，依次加入不同體積青蒿素溶液，Tris-HCl緩沖溶液定容至3 mL，充分混合在恒溫水浴中繼續作用30 min，獲得EB-DNA-QHS三元體系。掃描熒光發射光譜，激發波長(λx)488 nm，發射波長范圍550～700 nm，激發(Ex)/發射狹縫(Em)為10 nm/5 nm。

2.2.3 共振散射光譜

依次將1 mL Tris-HCl緩沖溶液、280 μL 4.5×10-4mol/L DNA儲備液和一定量1.0×10-4mol/L青蒿素溶液加入到7 mL比色管中，Tris-HCl緩沖溶液定容至3 mL，充分混合后在室溫下作用30 min。λem=λex進行同步掃描，得到共振散射光譜，激發/發射波長均為200～700 nm，狹縫設定同前。

2.2.4 分子對接模擬

由Auto Dock Tools軟件平臺進行分子對接計算。首先在小分子數據庫(Zinc)中獲得小分子青蒿素晶體結構(ZINC ID:452191)。由蛋白質數據庫(Protein data bank，PDB)中獲取小牛胸腺 DNA 晶體結構(PDB ID:1BNA)，利用 Auto Dock4對其進行去水、加氫、加電荷等一系列初步處理。分子對接位點的活性區域包含整個DNA分子，活性區域大小為40 nm×40 nm×16 nm，格點步長為16 nm。使用拉馬克遺傳算法(LGA)對可能的構象和結合位點進行充分搜索，以結合能量最低的結構作為相互作用的最優模式。

3 結果與討論

3.1 紫外吸收光譜法研究青蒿素與DNA的相互作用

3.1.1 青蒿素對DNA紫外吸收光譜的影響

青蒿素與DNA作用的紫外吸收光譜如圖1所示。由圖可知，青蒿素在220 nm區域顯示出了較弱的吸收峰帶，這是由于青蒿素氧上的孤對電子與雙鍵之間發生了n→π*電子躍遷(見曲線1)。而DNA在258 nm的吸收峰源于堿基共軛雙鍵結構(見曲線2)。與青蒿素作用后，DNA特征吸收峰出現減色效應，但最大吸收波長無明顯偏移現象(見曲線3～5)。一般認為，小分子化合物與DNA相互作用后，若吸收光譜發生減少、紅移，則表明小分子化合物是以嵌插方式與DNA結合，減色率大小及紅移程度能初步反映小分子化合物與DNA相互作用的強弱；而小分子化合物若以靜電作用與DNA結合，則峰位不發生改變，但有強度變化[12,15]。由此推斷，青蒿素與DNA的結合模式可能為靜電或分子部分結構發生嵌插作用。

1:cQHS=2.0×10-5 mol/L; 2～5: cDNA=2.25×10-5 mol/L, cQHS=(0, 2.0, 6.0, 10.0)×10-6 mol/L.

3.1.2 青蒿素對DNA熔點的影響

小分子化合物以嵌插模式與DNA結合時，能增加雙螺旋結構穩定性，DNA熔點(Tm)可提高5～8 ℃，而非嵌入式結合一般對DNA的Tm影響不大[16]。將DNA和DNA-QHS溶液分別放置于20～95 ℃環境中，10 min后迅速取出并測量A258 nm。根據fss=ΔA′/ΔA=(A-A0)/(Af-A0)(A為表觀吸光度，A0為起始吸光度，Af為最終吸光度)[17]，獲得fss關于T的曲線，熔解曲線fss= 0.5處所對應的溫度即為Tm，結果如圖2所示。可以看出，DNA與青蒿素作用前后Tm分別為77 ℃和82 ℃，即Tm增加了5.0 ℃。因此，青蒿素與DNA發生了嵌插作用，該作用增加了DNA雙螺旋結構穩定性。這與文獻[14]結果一致。

cDNA=3.7×10-5 mol/L, cQHS =9.0×10-5 mol/L.

3.2 熒光光譜法研究青蒿素與DNA的相互作用

DNA雖無內源性熒光，但可以通過熒光探針法研究其與青蒿素的相互作用。溴化乙錠(EB)是一種典型的DNA嵌入試劑，本身熒光強度不大，當嵌入到DNA堿基對間時，其熒光強度顯著地增大，所以，EB被廣泛應用于篩選抗腫瘤藥物以及小分子與DNA間相互作用的研究[12,18]。不同濃度的青蒿素對EB-DNA體系的熒光猝滅光譜如圖3所示。可以看出，濃度逐漸增加的青蒿素引起了EB-DNA體系601 nm處熒光強度顯著降低，峰位略紅移(3 nm)。造成熒光猝滅的原因有以下兩種可能：(1)青蒿素、EB與DNA的結合位點相同，兩者競爭結合導致嵌插進DNA中的部分EB被置換出來；(2)青蒿素、EB與DNA結合位點不同，青蒿素嵌插進DNA堿基對，引起DNA構象改變及EB被擠出。無論是以上哪種原因，青蒿素均以嵌入方式與DNA發生結合，所生成QHS-DNA二元體系具有低熒光強度的特點，這與紫外吸收光譜和熔點實驗結論是一致的。

cDNA =1.5×10-5 mol/L, cEB =1.8×10-6 mol/L, 1～7: cQHS=(0, 1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 9.0, 11.0)×10-6 mol/L.

3.2.1 熒光猝滅方式

為探討青蒿素對DNA-EB的熒光猝滅機制，采用Stern-Volmer方程[19-20]F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]處理數據。以F0/F對[Q]作圖，Stern-Volmer擬合，由直線斜率可獲得青蒿素對DNA-EB體系的猝滅常數Kq和Ksv值。由表1可知，Ksv值隨溫度的升高而降低，且Kq的數量級為1012，大于2×1010L/(mol·s)[12](最大碰撞速率常數)，說明青蒿素對EB-DNA熒光強度的猝滅類型為靜態猝滅。

由Lineweacer-Burk雙對數方程 (lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q])[12]求得青蒿素與EB-DNA的結合常數Ka和結合位點數n。具體為：T=298 K時，Ka、n為1.43×103L/mol和0.76；T=304 K時，Ka、n為0.99×103L/mol和0.74。結合常數隨溫度的升高而降低，說明溫度是影響結合能力的有力因素。而Ka數量級在102～103，低于經典DNA嵌插劑EB的結合常數(Ka= 1.4×106L/mol)[21]。這進一步證明青蒿素雖然以嵌插方式與DNA結合，但青蒿素分子僅有部分結構嵌入到DNA堿基對中，其嵌插能力弱于EB。

表1 不同溫度下青蒿素對DNA-EB的猝滅參數

3.2.2 熱力學參數及非共價鍵類型

小分子與生物大分子間的主要結合力可以通過熱力學參數(ΔH、ΔS和ΔG)大小和符號進行判斷。當實驗體系溫度變化很小時，焓變可被視為常數，其熱力學參數可由Van’t Hoff方程[20]ln(KA2/KA1)=(1/T1- 1/T2)×ΔH/R和ΔG=-RTlnKa=ΔH-TΔS計算獲得。青蒿素與EB-DNA體系反應的熱力學參數結果見表2。根據Ross[22]的結果，ΔH<0、ΔS<0是范德華力和氫鍵的特征，由此可以判斷，青蒿素與DNA間的相互作用力主要是范德華力和氫鍵。ΔG、ΔH為負值，表明該體系的結合為自發、放熱過程。

表2 青蒿素與EB-DNA熱力學參數

3.3 共振散射光譜法研究青蒿素與DNA的相互作用

青蒿素、青蒿素與DNA反應體系的共振散射光譜(RLS)分別見圖4(a)、(b)。可以看出，青蒿素自身在372.1～400.0 nm范圍有RLS信號，兩個尖銳峰位于450 nm和467 nm處，RLS強度隨著青蒿素濃度的增加而增大。依據文獻[12, 17]研究表明，RLS強度與散射粒子的濃度成正比，因此RLS信號出現增強。與青蒿素相比，DNA溶液的RLS信號比較弱小(見圖4(b)中曲線5)，當與青蒿素反應后引起了RLS信號增強(見圖4(b)中曲線1～4)，RLS強度隨青蒿素濃度增加而增大，其中以467 nm處的增強效果最為顯著，而且峰形發生了變化。這是由于青蒿素與DNA兩者間發生作用形成了復合物，該復合物在467 nm處有較強的RLS信號。體系中青蒿素濃度增大，使其嵌入到DNA堿基中分子亦增加，進而引起QHS-DNA復合物分子體積增大，分子量增加。因此，隨著青蒿素濃度的增加，QHS-DNA體系RLS信號強度增大。

(a)1～4: cQHS=(1.0, 2.0, 3.0, 4.0)×10-6 mol/L. (b)1～4: cQHS=(1.0, 2.0, 3.0, 4.0)×10-6 mol/L, cDNA=4.2×10-6 mol/L; 5: cDNA=4.2×10-6 mol/L.

3.4 分子對接法研究青蒿素與DNA的相互作用

(a)， (b): Molecular docking of QHS-dodecamer(1BNA) interaction. (c): Binding force and distance of QHS-DNA complex.

4 結 論

在模擬生理酸度(pH 7.4)條件下，運用紫外吸收光譜法、熒光光譜法和共振散射光譜并結合分子模擬手段，研究了青蒿素與小牛胸腺DNA的相互作用。結果顯示，在熵驅動下，青蒿素吡喃環部分結構能自發地嵌插到DNA小溝區域GA堿基對間，青蒿素與DNA間形成了復合物，氫鍵和范德華力是兩者間結合的主要非共價作用方式，其作用強度適中，過程為放熱反應。研究結果對于理解青蒿素與DNA作用機理以及進一步揭示青蒿素抗瘧、抗癌機制提供了理論基礎。