玻璃化深低溫法與去細胞光氧化技術制備同種異體小動脈體內性能比較

黃磊　匡鋒　賴軼權

【摘要】 目的：通過兔異體頸動脈旁路移植模型，對玻璃化深低溫及去細胞光氧化交聯處理的兔頸動脈進行體內性能比較，評價兩種血管作為臨床異體小血管替代物的可行性。方法：將36只SPF級純種兔隨機分成兩組，分別予以玻璃化深低溫處理的兔頸動脈及去細胞光氧化處理的兔頸動脈行異體頸動脈移植。實驗動物分別飼養觀察1周、2周和4周后，觀察移植血管的通暢情況及內膜增生情況。結果：超聲檢查發現術后4周去細胞光氧化組的累計通暢率顯著高于玻璃化深低溫組（P<0.05）。HE染色顯示玻璃化深低溫組術后免疫反應表現比較嚴重。去細胞光氧化組術后內皮細胞則生長良好，炎性細胞浸潤少。Ⅷ因子染色顯示，術后4周玻璃化深低溫處理組內皮細胞有不同程度的破壞；而去細胞結合光氧化組內皮生長良好。通過圖像分析發現，移植后1周兩組血管內/中膜比差異無統計秀而意義（P>0.05），術后2周及4周內膜兩組血管內/中膜比差異有統計學意義（P<0.05）。結論：體內性能方面，去細胞光氧化技術制備同種異體小動脈生物穩定性、抗血栓性及內膜增生情況均要優于玻璃化深低溫處理的異體兔頸動脈，但同樣也存在瘤樣擴張，內膜增生等不足。

【關鍵詞】 去細胞光氧化； 玻璃化深低溫； 內膜增生； 異體小動脈

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.24.001 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2018）24-000-04

Comparison of in Vivo Performance of Small-diameterallogenic Arterioles Treated with Decellularization Associated with Photo-oxidation and Cryopreservation/HUANG Lei，KUANG Feng，LAI Yiquan，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（24）：-4

【Abstract】 Objective：To evaluate the feasibility of an alternative source of allogeneic arterioles in coronary artery bypass grafting，we build a model of rabbit allogeneic carotid bypass grafting and compared the in vivo performance of rabbit carotid arteries treated with decellularization associated with photo-oxidation and cryopreservation.Method：A total of 36 SPF purebred rabbits were randomly divided into two groups and separately given carotid bypass surgery with small-diameter allogenic arterioles treated with decellularization associated with photo-oxidation and cryopreservation.The experimental animals were reared for 1 week， 2 weeks and 4 weeks.the hemodynamics and patency of graft vessels were observed through transvascular ultrasound and the intimal hyperplasia of the grafts were observed.Result：Vascular ultrasound examinations revealed that the cumulative patency rate of decellularization associated with photo-oxidation group was significantly higher than that of cryopreservation group（P<0.05）.HE staining showed that the endothelial cells in the cryopreservation group had different degrees of shedding and hyperplasia，thrombosis in the lumen， and the immune response was much more severe.While the endothelial cells grow more well in the decellularization associated with photo-oxidation group with less thrombus formation and less inflammatory cell infiltration at the 4th week after surgery.Ⅷ factor staining showed that endothelial cells were disrupted and disorganized in the cryopreservation group while endothelial growth was much better in the ecellularization associated with photo-oxidation group 4 weeks after surgery.The image analysis system showed that there was no significant difference in intima/media ratio after the first week of bypass surgery （P>0.05），but significant difference began to occur between the two groups at 2 and 4 weeks postoperatively （P<0.05）.Conclusion：In terms of in vivo performances，the biological stability，antithromboticity，and intimal hyperplasia of rabbit allograft in the decellularization associated with photo-oxidation group were all superior to those of cryopreservation group，but there are also tumor-like expansion，intimal hyperplasia and other deficiencies existing for us to modify.

【Key words】 Decellularization associated with photo-oxidation； Cryopreservation； Intimal hyperplasia； Allogeneic arteriole

First-authors address：Shenzhen Hospital of Peking University，Shenzhen 518000，China

包括冠心病（CHD）和外周動脈疾病（PAD）在內的閉塞性動脈疾病，是導致人類意外死亡的主要原因之一，預計至2030年該類疾病導致的全球死亡率將上升為2330萬[1]。對于閉塞性動脈疾病，目前的血運重建技術主要包括血管成形、支架植入和手術搭橋三種。而手術搭橋的橋血管來源方面，自體血管仍是小口徑血管的“金標準”移植物[2]，目前臨床上比較常用的有大隱靜脈、胸廓內動脈、橈動脈等。然而獲取這一類血管往往需要進行額外的手術操作，并且所截取的血管往往無法達到臨床使用的要求。人工合成的血管移植物是自體血管的有效替代物，目前該類人工血管已經廣泛用于大、中等直徑的動脈（如頸動脈或股總動脈）的手術操作，雖取得了令人滿意的長期結果，但當應用于小直徑血管時，如冠狀動脈和膝關節以下的動脈時，遠期通暢率遠不能達到臨床要求[3]。考慮到目前的血管旁路管道的局限性，具有生長、重塑和體內修復能力的異體來源的小血管，為血管手術的未來提供了一種潛在的解決方案。本實驗通過研究比較玻璃化深低溫法、去細胞光氧化法這兩種技術處理后的異體小血管，對比兩者在組織結構及抗原性方面的變化，以期為同種異體小血管移植的臨床應用提供一種新的思路。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及材料

1.1.1 實驗動物及分組 36只SPF級純種兔，雌雄不限，年齡6～12個月，體重1.5～2.5 kg。由廈門大學醫學實驗中心提供。采用隨機數字法，將動物隨機分成2組，玻璃化深低溫處理組（n=18）及去細胞光氧化組（n=18）；分別采用玻璃化深低溫處理的異體兔頸動脈及去細胞光氧化處理的異體兔頸動脈行移植搭橋。

1.1.2 血管預處理 去細胞光氧化處理兔頸動脈：依據前期實驗中所取得的最佳去細胞過氧化方案及玻璃化深低溫保存方案[4]，玻璃化深低溫處理的兔頸動脈置于液氮中保存，2周后40℃水浴復溫，平衡液洗脫后備用。經去細胞處理的兔頸動脈置無菌PBS液中，充分沖洗脫色后備用。

1.2 方法

實驗用兔術前禁食4 h，肝素200 U/kg經耳緣靜脈注射，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔內注射麻醉。麻醉成功后，仰臥位固定于手術臺，刮凈術區皮膚，絡合碘消毒，鋪蓋無菌巾。頸部正中切開皮膚，游離皮下及各肌層，沿氣管分離右側頸總動脈，遠、近心端各置血管夾，兩夾之間相距1.5 cm左右，切除其間動脈。取相應各組移植血管，裁剪成相應長度，予9-0無創縫線行連續端端縫合，手術完畢后逐層縫合各組織。動物蘇醒后常規肌注青霉素20萬單位/只（1次/d）共3 d，飼料用混合飼料，術后密切觀察。

1.3 觀察指標及評價標準

1.3.1 多普勒血管彩超檢查 分別于術后1、2及4周采用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg行腹腔注射麻醉實驗兔。經HPsonos4500型超聲成像探頭（頻率10 MHz）檢測移植血管通暢情況。如管腔內無實性低回聲區，透聲好，血流頻譜呈動脈頻譜，提示移植血管管腔通常；而局部出現實性回聲區提示移植血管內血栓形成，血流信號消失提示移植血管閉塞。明確實驗兔頸動脈移植血管通暢程度后，于耳緣靜脈內注射肝素抗凝（3 mg/kg），經原切口取出移植兔頸動脈，沿長軸縱行剪開移植血管，肉眼觀察大體形態；然后剪取部分血管組織，置入10%福爾馬林內保存。分別進行下述指標的對比檢測。

1.3.2 大體觀 各組標本取出后，觀察管腔有無血栓、管壁有無明顯增厚，變性，血管的大體形態（柔軟度、與周圍組織的粘連程度、鈣化等）。

1.3.3 光鏡觀察 每組取一小塊血管片，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅染色及彈力纖維染色后行光鏡觀察。

1.3.4 Ⅷ因子染色 通過Ⅷ因子染色檢測兔頸動脈血管腔面是否有內皮細胞生長，標本常規脫蠟和水化后按試劑盒介紹的標準程序進行第一、二抗體染色后置顯微鏡下觀察。

1.3.5 圖像分析系統觀察 參照Jacobs等[5]對胞核陽性標本的判定方法，從每張染色片上隨機選取5～7個視野，VIDAS圖像分析系統（德國歐波同公司）光鏡下按統一放大倍數（10×40倍）進行分析。在彈力纖維染色結果中計算內膜中膜厚度比代表增殖情況。

1.4 統計學處理

所有統計由統計軟件SPSS 13.0完成，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 手術及動物存活情況

術中及術后均無實驗動物死亡，所有存活動物無偏癱、頭頸歪曲，頸動脈搏動良好；兩組術后均有移植血管出現不同程度瘤樣擴張的現象，玻璃化深低溫組3例，去細胞光氧化組1例。術后1周，2周及4周沿原切口顯露雙側頸動脈未完全堵塞的移植血管可見搏動。去細胞光氧化組無閉塞、破裂情況，于遠端吻合口處切斷血管可見血液噴出，玻璃化深低溫組術后4周兩根移植血管于遠端吻合口處切斷后無血液噴出，提示完全堵塞。

2.2 超聲檢查

分別于術后1周，2周及第4周隨機抽取6只實驗動物行移植段血管超聲檢測，見圖1A，統計術后4周累計通暢率。檢測標準：血管管腔內局部發現實性低回聲區，提示局部有血栓形成，管腔內血流信號消失提示血管閉塞，見圖1B。結果顯示：去細胞光氧化組移植血管術后4周內均未發現血管閉塞，玻璃化深低溫組2根血管在第4周時出現信號消失現象，提示血管完全閉塞。但兩組血管中不同時段均可在血管管腔內發現局部的實性低回聲區，提示局部有血栓形成，見圖1B。術后1周血栓形成情況玻璃化深低溫組和去細胞光氧化組分別為1/6、1/6，術后2周兩組血栓形成情況分別為3/6、1/6，術后4周血栓形成情況分別為6/6、3/6，見表1。根據“確切概率法”用行×列表行字2檢驗，術后4周去細胞光氧化組累計通暢率高于玻璃化深低溫組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 各組大體觀察及HE染色光鏡觀察

所有移植血管樣本的大體觀察及HE染色顯示，玻璃化深低溫組術后1周移植血管搏動良好，顏色與自體血管一致，吻合口輕度粘連，HE染色顯示血管內壁欠光滑；免疫反應表現比較嚴重，中層及外膜可見淋巴細胞浸潤，第2周時，血管搏動可，顏色與自體血管基本一致，管壁變厚，管腔變窄；HE染色可見外膜中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，部分血管管腔內可見血栓形成。第4周時移植血管搏動不良，顏色變淺，較自體血管蒼白，移植段血管增生肥厚。管腔狹窄或堵塞，中層彈力纖維排列不連續，松散，部分管腔幾乎完全被血栓填充，見圖2A。去細胞光氧化組術后1周移植血管搏動良好，顏色與自體血管一致，與周圍組織無明顯粘連，血管內壁光滑；同時血管內壁見散在內皮細胞生長，外膜見少許淋巴細胞浸潤。第2周時，移植血管搏動良好，顏色與自體血管一致，與周圍組織輕度粘連，血管內壁光滑，可見明顯內皮細胞長入，血管管壁未見明顯破壞及變性改變，管壁彈性纖維連續致密，外膜淋巴細胞浸潤少。第4周時移植血管形態仍保持紅潤，與自體血管無明顯差異，HE染色顯示基本形成類似于正常血管壁的結構，管壁內彈性膜完整，彈性纖維連續性好，見圖2B。

2.4 Ⅷ因子染色

去細胞結合光氧化組Ⅷ因子染色陽性，有內皮樣細胞生長，見圖3A箭頭所示。而玻璃化深低溫處理組Ⅷ因子染色提示內皮細胞有不同程度的破壞甚至未見內皮細胞，見圖3B。

2.5 增生程度圖象分析

觀察彈力纖維染色玻片，使用圖像分析系統計算內膜/中膜厚度比（I∶M）代表內膜增殖程度。通過比較可見，兩組血管移植后1周I∶M比值差異無統計學意義（P>0.05）。術后2周，兩組移植血管的I∶M比值均有所升高，玻璃化深低溫組為（0.28±0.12），去細胞光氧化組為（0.23±0.11），差異有統計學意義（P<0.05）。術后4周，玻璃化深低溫組I：M比值為（0.45±0.15），要顯著高于去細胞光氧化組的（0.31±0.12），差異有統計學意義（P<0.05），見表2。玻璃化深低溫組術后4周I∶M比值較術后2周有顯著上升，而去細胞光氧化組移植血管的I∶M比值則上升的相對平穩。

3 討論

隨著外周血管手術技巧的逐步成熟，小口徑（<6 mm）血管移植物的需求增長迅速。但由于術后早期急性血栓的形成、內皮化的不完全及和遠期植入后的內膜增生，這些因素往往導致異體小血管的術后通暢率無法滿足臨床要求[6-7]。盡管植入后血栓事件是小口徑人工血管長期低通暢率的主要限制因素，但迄今為止，去細胞化的天然組織仍是臨床最廣泛的使用方法[8]。脫細胞處理存在一定的爭議，因為該過程的不完整可能導受體發生免疫原性反應，而過度的脫細胞處理又會導致移植橋血管機械性能的喪失及遠期動脈瘤發生的可能[9-10]。筆者將脫細胞后的兔頸動脈通過光氧化交聯固定，以期達到增強機械強度的目的，通過此次動物實驗4周的觀察，光氧化組術后無橋血管瘤樣擴張的情況發生。而相比較之下，18例玻璃化深低溫移植組的兔頸動脈中有3例移植血管發生了瘤樣擴張，前期實驗中我們曾證實去細胞過氧化處理的兔頸動脈熱皺縮溫度、抗張強度及最大拉伸距離要優于玻璃化深低溫處理的兔頸動脈[4]，從此次實驗中瘤樣擴張的發生概率來看，也側面證實了玻璃化深低溫處理對異體小血管機械性能存在一定程度的影響。

低溫保存技術是存儲同種異體大血管移植物的有價值的技術[11-12]。但低溫保存方法對移植物抗原性的影響一直存在爭論，主要分歧在于該處理方式對同種異體移植物抗原性的影響，對此不少學者進行了多方面驗證[13-15]。通過本次實驗的HE染色觀察，玻璃化深低溫處理的異體小血管在移植后早期淋巴細胞浸潤程度要明顯于去細胞光氧化處理的異體小動脈，后期血管重構程度也明顯不如去細胞光氧化組的異體小血管，血栓形成率更高（累及通暢率44.4% vs 72.2%）。提示玻璃化深低溫保存方法仍保存了血管組織的部分抗原性，從而引起宿主動物的免疫排斥反應。而去細胞光氧化反應組的移植血管因為血管前期處理時去除了最主要的抗原性內皮細胞，所以術后移植血管結構基本正常，管壁炎性細胞浸潤程度明顯減輕，術后4周對該組血管行Ⅷ因子染色檢測，均觀察到內皮細胞生長良好且均勻分布，彈力纖維連續，并且在有些管道外壁還可見較多新生血管的形成，提示該組移植血管兼容程度較好。前期實驗證實，去細胞光氧化是一個無細胞毒性的化學試劑參與過程，同時又保留了較完整的、無免疫排斥的血管基質[4]，因此內皮細胞更易于粘附生長，隨著移植血管內皮化程度逐步完全，血栓形成率大幅下降。

術后內膜增生也是玻璃化深低溫組異體小動脈的一個突出問題。通過比較術后兩組的I∶M比值發現，術后1周兩組移植血管的I∶M比無明顯差異，而術后2周兩組均有所上升，且上升程度有統計學差異（P<0.01），術后4周玻璃化深低溫組兔頸動脈I∶M比值上升程度較為顯著，而去細胞光氧化組的I∶M比值則相對平穩，提示去細胞光氧化組的近期效果優于玻璃化深低溫組。進一步比較兩組I∶M比值上升速率，提示去細胞光氧化組遠期通暢率亦優于玻璃化深低溫組。當然也有不足，因為從I∶M比值整體上升趨勢來看，去細胞光氧化組移植血管同樣也存在內膜增生的趨勢。

本次實驗證實，去細胞結合光氧化處理的異體兔頸動脈體內穩定性優于玻璃化深低溫保存的異體兔頸動脈，移植后具有更高的遠期通暢率。但同樣也存在瘤樣擴張，內膜增生等不足，提示我們在后續的實驗中需要采取相應的針對性措施以改進。

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（收稿日期：2018-07-09）