芪藶強心膠囊對心梗后心力衰竭大鼠脂質代謝的影響及作用機制分析

王亞紅

（河南省中醫院，河南 鄭州 450002）

慢性心力衰竭是臨床常見心血管疾病，近年來發病率逐漸上升[1]。目前尚未完全明確發病機制，有研究者指出，心肌病理重構、氧化應激反應、神經內分泌系統紊亂、水鈉代謝障礙等均參與心力衰竭的發病[2-3]。Wang JC等[4]研究發現，心力衰竭患者常伴脂質代謝紊亂，脂肪酸利用率降低，導致心臟脂質堆積，造成心肌缺氧，引起心肌細胞凋亡，增加脂毒性心臟病發病風險。此外，脂質堆積、脂代謝紊亂可引起血管緊張素水平上調，激活交感神經系統，加劇心衰[5]。中醫將心力衰竭歸于“水腫”“心痹”“心悸”等范疇，病位在心，本虛標實，癥見氣短乏力、心悸不安，氣血虧虛、心脈痹阻，治療需以益氣固脫、溫陽補氣為主。芪藶強心膠囊系中成藥制劑，具有利水消腫、活血通路、益氣溫陽等功效，目前已被證實可改善心衰患者心功能，調節神經內分泌激素及水液代謝[6]。但對心力衰竭患者脂質代謝的影響尚未見報道。本研究擬建立心衰大鼠模型，旨在探討芪藶強心膠囊對心梗后心力衰竭大鼠脂質代謝的影響及作用機制，報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠60只（上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證編號：SCXK(滬)2003-0003），5～8周齡，體質量200～220 g，平均體質量（210.5±3.4）g，自由攝食飲水，室溫23℃，濕度50 %～60 %，保持空氣流通，12 h交替光線照射。

1.2 主要藥物、試劑與儀器

鹽酸貝那普利片（深圳信立泰藥業股份有限公司），芪藶強心膠囊（石家莊以嶺藥業股份有限公司），游離脂肪酸（FFA）試劑盒（北京九強生物技術股份有限公司），3-硝基酪氨酸（3-NT）、8-異前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）酶聯免疫試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司），n-3、n-6系多不飽和脂肪酸標準品（美國Nu-chek公司），蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司），Agilent 7890A型氣相色譜儀、Version B.06.00數據處理軟件（均購自美國Agilent公司），Eppendorf微量離心機、連續加樣器、離心管（均購自德國Eppendorf公司），MYLAB Five動物超聲診斷系統（意大利百勝公司），AU5800型全自動生化分析儀（購自美國貝克曼庫爾特公司），DYZ-22A型雙恒定時電泳儀（北京六一儀器廠），UVP凝膠掃描系統（美國UVP公司）。

1.3 分組及建模

60只實驗大鼠隨機分為空白對照組、模型組、貝那普利組、芪藶強心組，各15只，除空白對照組外，均參照文獻[7]采用結扎冠脈左前降支法建立心肌梗死大鼠模型，心電圖顯示T波倒置或低平，ST段下降超過絕對值的0.1 mv視為造模成功，關閉胸腔。術后5周超聲檢測心功能，左室射血分數（LVEF）低于45%視為心力衰竭模型造模成功。正常對照組不予任何處理。

1.4 給藥方法

芪藶強心組予芪藶強心膠囊藥液（50 g芪藶強心膠囊藥粉+500 mL 0.9 %生理鹽水，藥液濃度0.1 g/mL）灌胃，1 g/（kg·d）（臨床等效劑量2倍），給藥體積10 mL/（kg·d），每日清晨灌胃；貝那普利組以貝那普利藥液（50 mg貝那普利研成細粉+500 mL 0.9%生理鹽水，藥液濃度0.1 mg/mL）灌胃，10 mg/（kg·d），給藥體積10 mL/（kg·d），每日清晨灌胃；空白對照組、模型組采用等體積生理鹽水灌胃，持續灌胃8 w。

1.5 取材

給藥8 w當日禁食12 h后處死大鼠，采集頸動脈血，抗凝血后混勻，離心后取上清，低溫保存；取心臟組織，生理鹽水沖洗，剪去心房及動脈，留取左室心尖心肌組織，10%多聚甲醛溶液固定。

1.6 指標檢測

①血漿指標測定。采用全自動生化分析儀檢測血漿FFA水平；采用酶聯免疫法測定各組大鼠血漿3-NT、8-iso-PG2α水平，酶標儀擬定標準曲線，檢測各孔OD值，獲取3-NT、8-iso-PGF2α濃度，均嚴格參照試劑使用說明操作。②心肌組織相關指標測定。采用Western blot法測定心肌組織3-NT蛋白水平，取心肌組織100 mg，加細胞裂解液裂解5 min，離心20 min，取上清液，加等量上樣緩沖液混勻，水浴加熱5 min，配置分離膠，加入異丙醇，分離膠凝固完畢后，雙蒸水沖洗，加入濃縮膠，室溫放置0.5 h，凝固后轉入電泳槽，加電泳緩沖液，電泳，轉膜，封閉，孵育，洗膜，采用雙色紅外激光成像系統進行圖像分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，將目標蛋白/GAPDH灰度比值作為3-NT蛋白相對表達量；采用氣相色譜法測定心肌組織多不飽和脂肪酸（PUFAs）水平，n-3系PUFAs標準品包括C18∶3 n-3、C20∶5 n-3、C22∶5 n-3、C22∶6 n-3甲酯標準品，n-6系PUFAs包括C18∶2 n-6、C20∶4 n-6、C22∶ 4 n-6甲酯標準品，制成 10 μg/μl正庚烷溶液，甲酯化大鼠心肌組織，250 μL正庚烷溶液復溶，采用氣相色譜儀進行分析，條件：聚乙二醇毛細管柱，柱溫：150 ℃，以每分鐘10 ℃升溫至190 ℃，維持58 min；后以每分鐘20 ℃升溫至230 ℃，維持15 min；保持氮氣流量超過5 mL/min，空氣流量400 mL/min，氫氣流量30 mL/min，各組心肌組織均進行色譜分離，復溶后測定樣品脂肪酸甲酯濃度，PUFAs =復溶后樣品脂肪酸甲酯濃度×復溶體積/（脂肪酸甲酯摩爾質量×組織用量）。

1.7 觀察指標

①比較各組大鼠8 w后血漿3-NT、8-iso-PGF2α、FFA水平；②比較各組大鼠心肌組織3-NT蛋白表達水平；③比較各組大鼠心肌組織n-3系PUFAs水平；④比較各組大鼠心肌組織n-6系PUFAs水平；⑤分析心梗后心力衰竭大鼠血漿FFA水平與心肌組織n-3系、n-6系PUFAs的相關性。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠8 w后血漿3-NT、8-iso-PGF2α、FFA水平比較

模型組、貝那普利組、芪藶強心組血漿3-NT、8-iso-PGF2α、FFA水平均高于空白對照組（P＜0.05），貝那普利組、芪藶強心組血漿上述指標水平低于模型組（P＜0.05），芪藶強心組上述指標低于貝那普利組（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠心肌組織3-NT蛋白表達水平比較

模型組、貝那普利組、芪藶強心組心肌組織3-NT蛋白表達水平高于空白對照組（P＜0.05），貝那普利組、芪藶強心組心肌組織3-NT蛋白表達水平低于模型組（P＜0.05），芪藶強心組心肌組織3-NT蛋白表達水平低于貝那普利組（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠心肌組織n-3系PUFAs水平比較

模型組、貝那普利組、芪藶強心組心肌組織n-3系PUFAs水平均低于空白對照組（P＜0.05），貝那普利組、芪藶強心組心肌組織n-3系PUFAs高于模型組（P＜0.05），芪藶強心組心肌組織n-3系PUFAs水平高于貝那普利組（P＜0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠心肌組織n-6系PUFAs水平比較

模型組、貝那普利組、芪藶強心組心肌組織n-6系PUFAs水平高于空白對照組（P＜0.05），貝那普利組、芪藶強心組心肌組織n-6系PUFAs低于模型組（P＜0.05），芪藶強心組心肌組織n-6系PUFAs水平低于貝那普利組（P＜0.05）。見表4。

2.5 心梗后心力衰竭大鼠血漿FFA水平與心肌組織n-3系、n-6系PUFAs相關性

心梗后心力衰竭大鼠血漿FFA水平與C18∶3 n-3、C22∶5 n-3呈負相關（r=-0.571、-0682，P＜0.05），與C18∶2 n-6、C20∶2 n-6、C22:4 n-6呈正相關（r=0.935、0.912、0.801，P＜ 0.05）。

表1 各組大鼠8 w后血漿3-NT、8-iso-PGF2α、FFA水平比較

表2 各組大鼠心肌組織3-NT蛋白表達水平比較

表3 各組大鼠心肌組織n-3系PUFAs水平比較

表4 各組大鼠心肌組織n-6系PUFAs水平比較

3 討論

心力衰竭系各類心臟病終末階段，患者生存率低，預后差[8]。有學者表示，大多數心力衰竭患者常伴心肌組織脂質堆積，脂肪酸利用率降低，膽固醇、甘油三酯合成增多[9]。脂肪酸為心肌組織重要能量底物，系構成脂肪的基本單位，其消耗增多，合成降低，直接造成心臟能量代謝紊亂，引起心肌缺氧、缺血，導致心臟結構及功能發生改變，誘發心力衰竭。同時心肌組織脂質聚集可能造成血壓上升，提高交感神經興奮性，加劇心功能衰竭。

PUFAs屬直鏈脂肪酸，參與血管生成、細胞增殖、有絲分裂、細胞凋亡及遷移等多類生理活性過程。馬柳一等[10]發現，n-3系、n-6系PUFAs在冠心病、高血壓、糖尿病等疾病發病過程中有重要作用。本研究發現，心力衰竭大鼠模型血漿3-NT、8-iso-PGF2α、FFA及心肌組織3-NT蛋白、n-6系PUFAs水平均較空白對照組高，心肌組織n-3系PUFAs水平低于空白對照組，提示心衰大鼠模型存在心肌細胞脂質能量代謝障礙及脂肪酸堆積表現，顯著表現為血漿脂質水平上調，心肌組織n-3系PUFAs水平下調，n-6系PUFAs濃度上升。另外，心衰大鼠血漿FFA水平與C18:3 n-3、C22:5 n-3呈負相關，與C18:2 n-6、C20:2 n-6、C22:4 n-6呈正相關，提示血漿脂肪酸水平與n-3系、n-6系PUFAs調節存在顯著關聯。

8-iso-PGF2α系F2α異構體前列腺素家族成員，在體液內表達水平恒定，是用于評定脂質過氧化反應的常用指標；3-NT則為酪氨酸殘基硝基化所生成的穩定終末期產物，可增強硝化應激反應，加重心力衰竭程度，兩者表達上調提示心力衰竭大鼠機體存在明顯脂質過氧化反應及硝化反應。n-3系、n-6系均為PUFAs關鍵構成部分，n-3系PUFAs攝入不足，n-6系PUFAs誘導類十二烷酸釋放增加，可促進前列腺素分泌，加重機體炎癥反應，導致血液黏度增加，增加血管痙攣程度，促進血栓形成，引起動脈粥樣硬化；而當n-3系PUFAs攝入過多時，可與n-6系PUFAs共同競爭，降低n-6系PUFAs水平，因此必須重視心力衰竭脂質代謝紊亂的調節。

芪藶強心膠囊主要成分包括黃芪、人參、附子、丹參、玉竹、葶藶子、澤瀉、桂枝、香加皮、陳皮、紅花等，具有益氣溫陽、強心通絡，活血通氣之功效，既往已被證實對血瘀絡阻疾病的治療效果肯定[11]。方中黃芪肥腠理、補陽氣、溫分肉、達益衛、利水消腫；附子入脾、腎、心經，可回陽救逆、補火助陽；人參大補元氣，復脈固脫；芪藶利水益氣；丹參活血化瘀，清心通絡；玉竹滋陰補腎；桂枝通陽化氣；配合澤瀉、香加皮為佐藥，可奏利水消腫之效。且現代藥理研究發現，芪藶強心膠囊可逆轉心肌重構，調節神經及內分泌[12]。本研究建立心衰大鼠模型，并應用芪藶強心膠囊灌胃干預，結果發現，芪藶強心組灌胃8w血漿3-NT、8-iso-PGF2α、FFA及心肌3-NT蛋白表達水平顯著低于貝那普利組及模型組，提示芪藶強心膠囊可抑制心衰大鼠脂質過氧化反應及硝化應激水平；同時灌胃8 w心衰大鼠心肌組織n-3系PUFAs水平高于貝那普利組及模型組，n-6系PUFAs水平低于貝那普利組及模型組，提示芪藶強心膠囊可調節心衰大鼠脂肪酸構成，改善脂肪酸能量代謝。

綜上，心梗后心力衰竭模型大鼠存在明顯脂質代謝紊亂表現，呈顯著脂質過氧化反應及硝化應激反應，伴心肌PUFAs結構紊亂，轉運、利用率降低。芪藶強心膠囊可下調血漿3-NT、FFA、8-iso-PGF2α、心肌組織n-6系PUFAs水平，增加n-3系PUFAs水平，提高脂肪酸轉運及利用率，改善心肌能量代謝紊亂。