自噬對成骨細胞調控作用的研究進展

郭健民 章嵐

1. 山東體育學院研究生教育學院，山東 濟南 250102 2.上海體育學院運動科學學院，上海 200438

自噬是細胞的一種自我消化行為，是真核細胞吞噬自身細胞質蛋白或細胞器的主要代謝過程[1]。在這個過程中細胞質內容物被包被進囊泡，并與溶酶體相融合形成自噬溶酶體，其中的內容物被降解以滿足細胞新陳代謝和更新細胞器的需求[2]。自噬在所有的細胞中均可發生，誘導細胞應激的因素如缺氧、熱量限制、氧化應激的積累等均可誘導自噬。自噬主要有三種類型：大自噬、小自噬和分子伴侶自噬[3]，我們通常所說的自噬是指大自噬。一般情況下自噬分為四個主要步驟：啟動、延伸、成熟和降解。Beclin-1、LC3(microtubuleassociated protein 1 A/1B light chain 3)、p62以及自噬相關基因(autophagy-related gene，ATG)參與自噬的主要過程，并被作為常用的自噬標志物[4]。自噬在正常和應激情況下均可調控細胞死亡、控制細胞生長和分化，已有的研究表明自噬可能是通過細胞器和蛋白質的轉換，來改變細胞分化和發育過程中結構的變化，但其作用機制尚未完全明確[1]。

成骨細胞是由多能間充質干細胞分化而來的單核細胞，間充質干細胞也可以分化為成纖維細胞、軟骨細胞、成肌細胞、脂肪細胞，該分化過程受相關信號轉導通路的調控[5]。成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，主要負責骨基質的合成、分泌和礦化。成骨細胞可以產生細胞外基質蛋白和基質礦化調節因子，以此參與早期的骨形成和晚期的骨重建。成骨細胞主導的骨形成主要包括成骨細胞的增殖、分化和礦化三個過程，該過程受到嚴格的調控，若調控異常會導致包括骨質疏松在內的骨疾病發生[6]。最新研究表明自噬相關基因介導間充質干細胞向成骨細胞分化的過程，同時在成骨細胞的活性、增殖、凋亡、分化以及骨基質的礦化中發揮關鍵性的調控作用(表1)。此外自噬還可通過調控成骨細胞功能活性，在骨質疏松和骨折愈合中發揮關鍵性作用。

表1 自噬相關基因對成骨細胞的影響Table 1 The effect of autophagy-related genes on osteoblasts

1 自噬對成骨細胞形成的調控

成骨細胞來源于間充質干細胞，主要負責骨形成和發育[7]。間充質干細胞向成骨細胞的分化受到相關的成骨分化因子Runx2(runt-related transcription factor 2)、PPARγ2(peroxisome proliferator-activated receptor γ2)、Osterix、BMP(bone morphogenetic protein)等的調控[5]，最新研究發現自噬在該分化過程中呈現不同的水平，并通過影響成骨相關因子的表達參與調控該過程。Homma等[8]研究發現在hMSCs(human mesenchyymal stem cells)向成骨細胞分化的過程中LC3B的表達顯著增加，而通過敲除ATG7抑制hMSCs自噬后，在14 d時鈣化結節的數量顯著減少，這表明自噬可促進間充質干細胞向成骨細胞分化。此外Huang等[9]的研究也發現在間充質干細胞向成骨細胞分化的過程中，miR-211和ATG14的表達均顯著增加，使用siRNA抑制miR-211或ATG14的表達后，成骨分化標志物Osteocalcin、OPN(osteopontin)、Runx2的表達以及ALP(alkaline phosphatase)的活性均下降，該研究還發現抑制miR-211的表達后，ATG14蛋白和mRNA的表達也會相應的減少，這表明自噬相關基因介導了間充質干細胞向成骨細胞分化的過程，而microRNA作為調控自噬相關基因的上游也參與其中。Ichimura等[10]研究發現長時間使用艾滋病蛋白Nef干預間充質干細胞，會抑制細胞的增殖、誘導其衰老，并且會抑制LC3、Beclin-1的表達，增加P62的表達，同時還會使成骨分化標志物Runx2和Osteocalcin的表達降低，進而抑制間充質干細胞向成骨細胞分化，而使用雷帕霉素激活細胞自噬可有效的反轉Nef對間充質細胞的損害，這表明在應激情況下自噬也參與間充質干細胞向成骨細胞分化的過程。

2 自噬對成骨細胞功能的影響

2.1 自噬對成骨細胞活力、凋亡、增殖的影響

自噬是細胞的一種自我保護機制，在不同的應激狀況下適度激活自噬可有效的保護成骨細胞的活性和功能，但過度激活自噬或抑制自噬均會對細胞產生不利影響。地塞米松是一種常見的糖皮質激素，常作為抗炎藥和免疫抑制藥物用于各種疾病的治療。長期或者過量使用糖皮質激素會導致骨質疏松和股骨頭壞死[11-12]，而最新研究表明地塞米松過度激活成骨細胞自噬，這可能是導致上述疾病的主要原因。Kang等[13]研究發現使用0.1、1、10 μmol/L的地塞米松干預MC3T3-E1成骨細胞24 h后，可誘導細胞自噬，增加成骨細胞凋亡、降低細胞活性，同時加入地塞米松和自噬抑制劑3-MA(3-Methyladenine)后，成骨細胞活性增加、凋亡率下降，這表明在較高劑量(>10-8mol/L)的地塞米松干預下自噬對細胞具有損害作用。Kenanidis等[14]研究發現低劑量的地塞米松(10-8、10-9mol/L)可顯著增加細胞活性，其中10-8mol/L的地塞米松誘導自噬的效果最佳，自噬在6 h時達到峰值，同時加入地塞米松(10-8mol/L)和3-MA后，細胞活性降低，且在正常情況下抑制自噬對細胞活性未產生顯著影響，這表明在低劑量的地塞米松干預下自噬對細胞活性具有保護作用。上述研究結果表明低劑量的地塞米松可適度激活自噬，對成骨細胞有保護、促進作用，而高劑量的地塞米松則會過度激活自噬，對成骨細胞產生不利影響，這為進一步明確糖皮質激素對人體骨骼影響的機制提供了有力的依據。

已有研究[15-16]表明自噬介導了骨骼疾病治療藥物發揮功效的過程，同時過度的激活或抑制自噬也被認為是某些藥物如雙膦酸鹽產生毒副作用的主要原因。雙膦酸鹽是常見的骨質疏松治療藥物，但長期使用會加速骨骼病變，嚴重的可引起顎骨壞死。Levine等[17]研究發現雙膦酸鹽會降低成骨細胞(hFOB 1.19)的活性并誘導其凋亡，高良姜素則可有效的激活成骨細胞自噬，進而反轉雙膦酸鹽對成骨細胞的損害，但抑制自噬后高良姜素對成骨細胞的保護作用減弱，這表明類黃酮可通過激活細胞自噬來維持細胞的活性。氨基葡萄糖是治療骨性關節炎的有效藥物，但其對成骨細胞的影響尚不明確。Li等[18]研究發現低劑量(<0.6 mmol/L)的氨基葡萄糖在24 h和48 h時可顯著增加成骨細胞活性、促進細胞增殖，并可誘導細胞自噬，而高劑量(>0.8 mmol/L)的氨基葡萄糖會顯著降低細胞活性、抑制細胞增殖和自噬；同時使用自噬抑制劑3-MA和低劑量的氨基葡萄糖干預成骨細胞48 h后，成骨細胞中自噬標志物LC3、Beclin 1的表達增加，p62表達降低，同時細胞活性和增殖顯著降低，這表明在低劑量的氨基葡萄糖干預下，自噬可促進成骨細胞增殖。鉭納米材料是比鈦更好的生物替換材料，其具有更高的潤濕性和更大的表面能，可以更好的促進早期生物固定[19]。Liu等[20]研究發現10μg/mL的鉭納米粒子可使MC3T3-E1細胞的活性增加20% 和18.7%，同時增加LC3B的表達，降低p62的表達；使用鉭納米粒子干預成骨細胞24 h后，加入雷帕霉素或3-MA干預1 h發現，激活自噬可顯著增加成骨細胞活性，而抑制自噬可以逆轉鉭納米粒子對細胞活性的促進作用，這表明鉭納米粒子刺激下自噬可促進成骨細胞的活性。

在大多數應激情況下，適宜的自噬都會對成骨細胞起到相應的保護作用，促進成骨細胞增殖并減少凋亡。自噬介導了各類骨疾病治療藥物對成骨細胞的影響，但目前自噬影響成骨細胞活性的機制尚未完全闡明。已有的研究[21]表明自噬可能通過轉運蛋白DMT1(divalent metal transporter 1)和相關的信號通路RAGE/Raf/MEK/ERK[22]實現對成骨細胞活性的調控。明確自噬的調控機制并將其應用于臨床骨骼疾病藥物的研發將是未來的一大研究熱點。

2.2 自噬對成骨細胞骨形成作用的影響

成骨細胞在骨形成和骨重塑中發揮重要的作用，其通過骨基質的合成、分泌和礦化來控制骨重塑。細胞外基質礦化發生在成骨細胞分化的終末期，并被認為是成骨細胞成熟的標志[23]。已有研究[24-25]表明成骨細胞的分化可以影響骨形成，成骨細胞分化和功能的缺失會導致各種疾病如：骨質疏松、骨折愈合遲緩、股骨頭壞死等。無論是細胞實驗還是在體實驗中都證實，自噬對成骨細胞的功能產生一定的影響。Neve等[26]研究發現在MC3T3-E1細胞中激活AMPK(adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase)可誘導成骨細胞自噬，增加LC3B的表達、降低p62的表達，同時還可促進成骨細胞分化和礦化，使用3-MA抑制成骨細胞自噬后，成骨分化標志物ALP、OCN和Runx2的表達下降，這表明在AMPK活化的情況下自噬對成骨細胞的骨形成具有促進作用。Nollet等[27]研究發現在正常情況下，抑制或激活自噬不會對成骨細胞分化標志物Runx2、Colla1、OCN的表達產生影響，而在有地塞米松干預的情況下抑制自噬會降低上述三個成骨分化標志物的表達，激活自噬會增加這三個基因的表達。Ozeki等[28]研究發現10 μmol/L的山奈酚不會對MC3T3-E1成骨細胞的活性產生顯著影響，但可增加Runx2、Osterix、BMP-2 和I型膠原的表達，進而誘導成骨細胞分化和礦化，同時Western-blot檢測發現自噬標志物LC3表達增加、P62表達降低，加入3-MA抑制自噬后，成骨分化標志物Runx2、Osterix、BMP-2的表達降低，這表明在山奈酚干預下自噬可促進成骨細胞的分化和礦化。Ozeki等[29]研究發現BMP-2可誘導成骨細胞分化同時增加ATG7的表達，使用siRNA抑制ATG7的表達后，成骨細胞分化標志物BGLAP(bone gamma carboxyglutamate protein)、SPP1(secretedphosphoprotein1)和Osterix的表達減少，反轉了BMP-2對成骨分化的促進作用，這表明BMP可通過增加自噬來促進成骨分化。

上述細胞實驗表明，在正常情況下激活或抑制自噬不會對成骨細胞的分化和礦化產生影響，但在地塞米松、山奈酚、AMPK活化等情況下，自噬可有效的促進成骨細胞分化和骨基質的礦化。此外在動物實驗中也發現自噬影響成骨細胞分化和骨生成。ATG7參與吞噬泡的伸長和LC3的脂化[30]。Puri等[31]通過雜合子小鼠雜交建立成骨細胞譜系缺失ATG7的模型發現，ATG7缺失后小鼠的骨量、骨小梁數量、骨小梁厚度均顯著下降，同時成骨細胞的數量以及骨生成速率也顯著下降，這表明抑制成骨細胞自噬水平會使成骨細胞的功能受限。Quarles等[32]研究發現在小鼠成骨細胞中敲除p62后，小鼠的骨量、骨小梁厚度、成骨細胞的數量均顯著低于野生型小鼠，同時還能激活NF-κB通路，而NF-κB抑制劑 可反轉p62缺失對成骨分化標志物表達的影響，這表明在成骨細胞中自噬缺失會激活NF-κB通路進而抑制成骨分化。Beclin-1參與自噬的啟動過程，并且可以調控自噬體的形成和成熟[33-34]。Tchetina等[35]研究發現在成骨細胞系UMR-106和原代成骨細胞礦化的過程中LC3的表達均顯著增加，抑制UMR-106細胞中ATG7和Beclin-1的表達后，礦化結節的數量顯著減少，此外該研究還通過建立成骨細胞中限定性敲除基因ATG5的小鼠模型發現，ATG5的缺失同樣會降低成骨細胞的礦化能力，這表明自噬在成骨細胞礦化的過程起關鍵性的促進作用。Weinstein等[36]研究發現低劑量和高劑量的褪黑素可增加2型糖尿病小鼠的骨密度、骨小梁數量和骨小梁厚度，同時降低骨組織中LC3和Beclin-1的表達；通過細胞實驗發現，高糖會使hFOB 1.19 細胞自噬水平提高，成骨分化能力降低，而使用褪黑素和3-MA均可有效的抑制成骨細胞自噬，提高成骨標志物ALP和OCN的表達進而促進成骨分化。

早期的骨骼發育以及后期的骨重塑中，骨形成都是持續存在的；骨形成活動異常會導致骨骼發育異常和骨骼疾病。上述研究表明自噬相關基因ATG7、Beclin-1、p62、ATG5等均介導了成骨細胞的骨形成過程。通過明確自噬對成骨細胞功能的影響，為探索骨骼病理狀況發生機制提供有力的理論支撐。

3 自噬在骨疾病中對成骨細胞的調控

骨質疏松是一種以全身性骨量減少以及骨組織微觀結構退化為特征的疾病，會導致骨強度降低、脆性增加、骨折風險增加。在絕經后骨質疏松病人和骨質疏松動物模型中成骨細胞的活性均顯著下降[37]。Yang等[38]研究發現在絕經后骨質疏松患者外周血中 mTOR、Runx2和ALPL的表達較正常人下降，相關性分析發現mTOR的表達與Runx2的表達正相關，股骨骨密度與Runx2的表達存在正相關，這表明絕經后骨質疏松患者骨密度的降低可能與自噬相關基因mTOR存在關聯。對骨質疏松大鼠給于β-蛻皮甾酮干預后，大鼠成骨標志物Runx2、BMP2與自噬標志物Beclin-1、ATG5、LC3I/II、Bcl-2的表達均顯著增加，microCT檢測發現大鼠椎骨的骨密度、骨量、骨小梁的數量、骨小梁厚度均顯著增加[39]，這表明自噬水平的增加與骨質疏松的緩解存在關聯。

骨折是一種常見的損傷，骨折愈合遲緩或骨不連在骨折中發生的概率為5%～10%[40]。Zhang等[41]研究發現在股骨骨折的大鼠模型中，骨組織自噬水平在24 h時達到峰值，之后逐漸下降，但在3天和7天時仍高于對照組；使用雷帕霉素干預后骨折的愈合顯著加快，并可增加細胞的自噬水平，降低Bax的表達，增加Bcl-2的表達，顯著減小骨折骨小梁間隙、增加骨小梁周圍成骨細胞數量。Zhu等[42]的研究也發現對股骨骨折的大鼠給于雷帕霉素干預后，大鼠骨組織中rpS6的表達受到抑制，LC3的表達增加，同時骨折處愈傷組織礦化和愈傷組織形成增加。這表明在骨折中激活自噬可提高成骨細胞的活性和增殖、抑制成骨細胞凋亡、促進骨形成進而加速骨折愈合。

在骨質疏松和骨折中，自噬可通過對成骨細胞功能和活性的調控影響疾病的發生發展，這為臨床骨疾病的治療提供潛在的靶點。

4 小結

眾多的研究表明自噬可通過維持成骨細胞的活性來維持機體骨量的平衡。細胞實驗和在體實驗也都證實了自噬在正常情況下和不同的應激下，對成骨前體細胞向成骨細胞分化的過程以及成骨細胞的活性、增殖、凋亡和礦化等產生一定影響。過度激活或抑制自噬均會對細胞產生損害，適宜的自噬水平則會對成骨細胞的功能活性起促進作用，但其作用機制尚未完全明確。此外在骨質疏松等骨疾病中自噬發揮重要的調控作用[43]，目前的研究主要集中于自噬的作用機制，未來需要通過更多的臨床實驗來探究自噬功能障礙與骨質疏松之間的關系，從而研究出預防和治療骨質疏松新方法。