疏血通注射液體外抗栓及抗凝作用研究

陳艷明 ，夏 珂 ，何 楊 ，趙赟霄 ，張忠兵 ，江 淼 *，鄭順亮 ，王思瑤 ，周劍波 ，白 芳

疏血通注射液（以下簡稱疏血通）是由水蛭和地龍的提取物精制而成的中藥注射制劑。疏血通注射液在臨床心、腦血管血栓性疾病治療中具有較好的抗凝、溶栓功效［1-3］，但其具體的分子生物學機制尚未完全明了。本研究觀察疏血通作用下正常人外周血中與凝血、纖溶及血小板功能相關的指標變化，判斷其主要作用方向，探討疏血通注射液可能的抗凝、溶栓機制，并估算其有效作用濃度。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年5—7月，收集來自江蘇省血液研究所的6例健康獻血者的外周血，中位年齡37歲，男女各半。健康獻血者血常規指標、凝血指標、纖溶指標、血小板功能檢測以及體外血栓形成檢測均在參考范圍內。

1.2 藥品 疏血通購自牡丹江友搏藥業股份有限公司，制劑形式：干粉。

1.3 儀器及試劑 全自動血凝儀（法國Stago公司）；全自動五分類血球計數儀（日本SYSMEX公司）；血小板聚集儀（美國Chrono-log公司）；血栓彈力儀（日本Hitachi公司）；流式細胞儀（法國Beckman公司）；B104-S分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；凝血檢測試劑（法國Stago公司）；血球計數試劑（日本SYSMEX公司）；組織纖溶酶原激活物（t-PA）測定ELISA試劑盒（英國Abcam公司）；纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）測定ELISA試劑盒（英國Abcam公司）。

1.4 實驗方法 采用同一健康獻血者的血液或血漿，以疏血通1份+血液或血漿9份（疏血通終濃度為20 μg/μl）作為加藥組，0.9%氯化鈉溶液1份+血液或血漿9份作為對照組。檢測兩組血常規指標、凝血指標、纖溶指標、血小板功能、體外血栓形成情況。

1.4.1 血常規指標檢測 EDTA抗凝全血，在Sysmax全自動血常規儀上檢測白細胞計數（WBC）、紅細胞計數（RBC）、血小板計數（PLT）、紅細胞比容（HCT）。

1.4.2 凝血指標檢測 （1）枸櫞酸鈉抗凝全血，混勻后室溫孵育15 min，隨后在全自動血凝儀上檢測活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）。（2）血塊退縮試驗：EDTA抗凝全血混勻后以200×g離心5 min分離出富血小板血漿（PRP），取PRP 0.6 ml加入10 ml玻璃試管中，37 ℃溫育3 min后加入0.05 mol/L CaCl2溶液，37 ℃溫育2 h后棄去血凝塊，計算血塊收縮率。血塊收縮率（%）=剩余血清體積/PRP體積×100%。（3）糾正試驗：枸櫞酸鈉抗凝全血，兩組血漿1∶1混合后在全自動血凝儀上檢測APTT、PT、TT。

1.4.3 纖溶指標檢測 （1）枸櫞酸鈉抗凝全血混勻后室溫孵育15 min，隨后在全自動血凝儀上檢測D-二聚體、纖維蛋白原（FIB）。（2）優球蛋白溶解時間（ELT）測定：枸櫞酸鈉抗凝全血混勻后以1 600×g離心10 min，分離出乏血小板血漿（PPP），測定ELT。（3）t-PA測定：EDTA抗凝全血充分混勻后以1 600×g離心10 min分離出PPP后，用0.9%氯化鈉溶液以1∶10稀釋，采用ELISA試劑盒檢測t-PA。（4）PAI-1測定：血漿及分離同（3），用0.9%氯化鈉溶液以1∶80倍稀釋，采用ELISA試劑盒檢測PAI-1。

1.4.4 血小板功能檢測 （1）血小板聚集試驗：枸櫞酸鈉抗凝全血充分混勻后以200×g離心5 min分離出PRP，剩余樣品以1 600×g離心10 min分離出PPP，在血小板聚集儀上以光學比濁法分別檢測4種誘導劑〔二磷酸腺苷（ADP）、瑞斯托霉素、膠原、凝血酶〕誘導的血小板聚集率。（2）血小板黏附試驗：枸櫞酸鈉抗凝全血，分別加入疏血通或者 0.9%氯化鈉溶液，37 ℃溫育15 min后加入50 μl鈣黃綠素溶液，37 ℃再溫育15 min。將上述血液以1 500 r/s的恒定剪切力流過事先包被膠原蛋白的玻璃平板（包被方法：人胎盤Ⅲ型膠原在pH值為3.0的醋酸溶液中溶解后以PBS溶液調整濃度至50 μg/ml，取200 μl涂布于載玻片中央，4 ℃靜置過夜），血液流盡后以0.9%氯化鈉溶液輕輕漂洗玻璃平板，將平板置于20倍熒光纖維鏡下計算血小板黏附率。（3）P-選擇素測定：枸櫞酸鈉抗凝全血充分混勻后室溫靜置15 min，取全血10 μl加入PE標記的抗P-選擇素抗體2 μl，37 ℃溫育15 min后加0.9%氯化鈉溶液0.5 ml，在流式細胞儀上檢測P-選擇素。

1.4.5 體外血栓形成檢測 枸櫞酸鈉抗凝全血，充分混勻后室溫孵育15 min，隨后在血栓彈力儀上檢測體外血栓形成情況，檢測R值、K值、α角、MA值。

1.5 統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以（s）表示，兩組間比較采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血常規指標 對照組WBC、PLT高于加藥組，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組RBC、HCT比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表1）。

2.2 凝血指標 對照組APTT、PT、TT、血塊收縮率分別為（37.7±3.9）s、（12.7±0.4）s、（17.2±0.9）s、（55.8±8.0）%，加藥組APTT、PT、TT、血塊收縮率分別為（46.8±5.7）s、（16.6±0.5）s、（34.9±2.0）s、（55.6±6.8）%，糾正試驗的APTT、PT、TT分別為（41.3±4.2）s、（14.0±0.5）s、（23.5±0.8）s。加藥組APTT、PT、TT長于對照組，差異有統計學意義（t配對=4.916、10.405、10.571，P值均＜0.001）；對照組與加藥組血塊收縮率比較，差異無統計學意義（t配對=0.133，P=0.897）。糾正試驗的APTT、PT、TT長于對照組，差異有統計學意義（t配對=4.499、8.614、8.085，P=0.001、＜0.001、＜0.001）；糾正試驗的APTT、PT、TT短于加藥組，差異有統計學意義（t配對=4.891、9.749、7.113，P值均＜0.001）。

2.3 纖溶指標 加藥組D-二聚體、t-PA高于對照組，FIB、ELT、PAI-1低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.4 血小板功能 加藥組ADP、瑞斯托霉素、膠原、凝血酶誘導的血小板聚集率低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組血小板黏附率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。加藥組P-選擇素高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

2.5 體外血栓形成 加藥組R值、K值長于對照組，α角、MA值小于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表4）。

表1 兩組血常規指標比較（s，n=6）Table1 Blood routine index changes between two groups

表1 兩組血常規指標比較（s，n=6）Table1 Blood routine index changes between two groups

注：WBC=白細胞計數，RBC=紅細胞計數，PLT=血小板計數，HCT=紅細胞比容

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表2 兩組纖溶指標比較（s，n=6）Table2 Changes in fibrinolysis related indicators between two groups

表2 兩組纖溶指標比較（s，n=6）Table2 Changes in fibrinolysis related indicators between two groups

注：FIB=纖維蛋白原，ELT=優球蛋白溶解時間，t-PA=組織纖溶酶原激活物，PAI-1=纖溶酶原激活物抑制劑1

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表4 兩組體外血栓形成變化（s，n=6）Table4 Changes of in vitro thrombosis between two groups

表4 兩組體外血栓形成變化（s，n=6）Table4 Changes of in vitro thrombosis between two groups

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表3 兩組血小板功能比較（s，n=6）Table3 Changes in platelet function between two groups

表3 兩組血小板功能比較（s，n=6）Table3 Changes in platelet function between two groups

注：ADP=二磷酸腺苷

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3 討論

疏血通有效成分為水蛭和地龍提取物，水蛭的活性成分——水蛭素，是一種特效的凝血酶抑制劑［4］。地龍主要成分為蚓激酶，蚓激酶具有類組織型纖溶酶原激活物的作用［5］，兩者結合具有強大的抗血栓形成和纖溶活性作用。疏血通有抗凝、抗栓、促纖溶等作用，但利用人血液進行系統的體外抗凝、抗栓、促纖溶研究較少。

本研究結果顯示，對照組WBC、PLT高于加藥組，可能是疏血通引起血小板之間或者血小板-白細胞聚集，這樣的細胞比白細胞大，血球計數儀不能識別這樣的聚集細胞導致儀器讀數下降，無臨床意義。加藥組APTT、PT、TT長于對照組，提示該藥對內源性凝血途徑和外源性凝血途徑均有影響，與黃越冬等［6］的研究結果一致，有利于延緩血栓的形成。加藥組D-二聚體、t-PA高于對照組，FIB、ELT、PAI-1低于對照組，這些纖溶指標的變化提示加入疏血通后，血液中纖溶活性增強，且促進了血栓溶解。

疏血通在較高濃度下對多種誘導物引起的血小板聚集以及血小板黏附均有抑制作用，提示藥物中的某些成分可能影響了血小板聚集的共同通路。血小板的磷脂表面以及血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa、糖蛋白Ⅰb等均可能是作用靶點。血塊收縮率無明顯變化，提示與血小板骨架相關的黏附分子不受影響。

本研究結果顯示，加藥組ADP、瑞斯托霉素、膠原、凝血酶誘導的血小板聚集率低于對照組，P-選擇素高于對照組，提示疏血通能明顯促進血小板表面P-選擇素的表達，藥物中的水蛭素可能是產生這一效應的原因。最新的研究認為，血小板表面P-選擇素的表達增加可以促進白細胞向血栓形成部位遷移、積聚，并最終與血小板、纖維蛋白原等交聯形成復合血栓，這種類型的血栓比純血小板血栓相對疏松，更易于被u-PA等纖溶促進物降解，這一機制有利于機體控制血管內血栓的過度生長，并且能降低缺血再灌注損傷，這或許能為臨床上疏血通對腦卒中患者腦神經的保護提供一些理論線索［7］。

在本實驗中疏血通起作用的有效濃度約為20 μg/μl，該濃度與藥品提供方之前在大鼠等動物中進行的體內試驗有效濃度相當，當濃度低于10 μg/μl時大多數前述有變化的指標與對照相比不再有意義［8］。在人體內用藥，或許需要一定的用藥時間的累積才能達到有效濃度，因此對該藥在體內的藥效學與藥動學之間的關系有必要做更多的研究。另一方面，通過對該藥中有效成分的進一步提取，有可能明顯降低給藥量。

綜上所述，疏血通可多方向、多靶點發揮抗凝、抗栓、促纖溶等作用。由于本文作者是在抗凝、抗栓、促纖溶藥效層面對疏血通抗栓作用的研究，尚未深入到機制研究層面，因此研究者后續可以針對此不足研究疏血通作用于凝血瀑布的具體絲氨酸蛋白酶、血小板功能及P-選擇素或PAI-1的生成或結合來闡明疏血通的抗栓作用機制。

作者貢獻：夏珂、張忠兵、江淼進行研究設計與實施、資料收集整理，撰寫論文并對文章負責；陳艷明、何楊、趙赟霄進行研究實施、評估、資料收集；鄭順亮、王思瑤、周劍波、白芳進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。