紅豆杉屬植物中紫杉烷類物質含量比較

姜艷，沈晨佳，周丹英，余琪*

(1.浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310023； 2.杭州師范大學，浙江 杭州 310018)

紅豆杉又名紫杉、赤柏松，為國家一級保護樹種。在我國，紅豆杉主要有4種、1變種，分別為中國紅豆杉、云南紅豆杉、西藏紅豆杉、東北紅豆杉、南方紅豆杉。此外，還有20世紀末引種我國的雜交品種曼地亞紅豆杉，其母本是東北紅豆杉，父本是歐洲紅豆杉[1]。

近年來，紅豆杉因植株中含有高效抗癌成分紫杉醇等活性成分而倍受關注[2]。臨床研究表明，紅豆杉在抗腫瘤方面具有較高的應用價值[3]。目前，從紅豆杉屬植物中已分離得到400多種紫杉烷類化合物，并且不斷有新的化合物被分離和鑒定[4-5]，大多數該類成分均顯示出較強的抗癌活性[6-7]。除紫杉醇外，10-脫乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)、巴卡亭Ⅲ、三尖杉寧堿和7-表-10-脫乙酰基紫杉醇(10-DAT)等也都是紫杉烷化合物，可作為紫杉烷類藥物半合成和修飾的起始原料，在抗癌藥物中得到了一定的應用。本文建立基于高效液相色譜(HPLC)檢測紅豆杉中上述5種紫杉烷類成分含量的方法，并對5種紅豆杉(西藏紅豆杉、云南紅豆杉、南方紅豆杉、東北紅豆杉、曼地亞紅豆杉)枝葉中的紫杉烷類成分含量進行對比研究，旨在為紅豆杉種源選育及野生資源保護利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

西藏紅豆杉(TaxuswallichianaZucc.)采自西藏墨脫縣，云南紅豆杉(TaxusyunnanensisCheng et L.K.Fu)采自云南德欽縣，南方紅豆杉[Taxuschinensis(Pilger) Rehd.var.mairei(Lemee et Levl.) Cheng et L.K.Fu)采自浙江德清縣，東北紅豆杉(TaxuscuspidataSieb.et Zucc.)采自吉林撫松縣，曼地亞紅豆杉(Taxus×media)采自安徽和縣。各樣品采摘時間均為夏季，經浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室馮尚國實驗師鑒定。

標準品：紫杉醇、10-DAB、10-DAT，購于阿拉丁，批號分別為1516034、1623007、LEAOP17；巴卡亭Ⅲ、三尖杉寧堿，購于四川成都曼斯特生物科技有限公司，批號分別為16090210、17022201。各標準品含量均在98%以上。

甲醇、乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

Aglient HP1200 高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器(DAD)。

1.2 色譜條件

1.2.1 10-DAB、10-DAT、巴卡亭Ⅲ、三尖杉寧堿

色譜柱：迪馬C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；理論塔板數按標準品計算，不低于8 000；檢測波長：227 nm；流速：0.8 mL·min-1。流動相A，乙腈；流動相B，水。采用梯度洗脫，分時流動相體積比(A∶B)：0～10 min，20∶80；10～30 min，33∶67；30～40 min，45∶55；40～60 min，50∶50；60～61 min，43∶57；61～75 min，43∶57。

1.2.2 紫杉醇

色譜柱：迪馬C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；理論塔板數按標準品計算，不低于8 000；檢測波長：227 nm；流速：0.6 mL·min-1。流動相A，甲醇；流動相B，乙腈；流動相C，水。流動相體積比A∶B∶C為0～30 min 21∶42∶37。

1.3 溶液配制

1.3.1 標準品溶液

分別稱取10-DAB、10-DAT、巴卡亭Ⅲ、三尖杉寧堿、紫杉醇標準品適量，加甲醇，制備成濃度分別為21.26、9.00、13.40、28.50、21.64 μg·mL-1的標準品溶液。

1.3.2 供試樣品溶液

取供試樣品粉末(過3號篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz，40 ℃以下)3次(每次加液量分別為50、30、20 mL)，每次30 min，過濾，合并濾液，減壓蒸干，殘渣以45 mL水-二氯甲烷(體積比1∶2)溶液分次溶解，轉移至分液漏斗中，分取二氯甲烷，水層加二氯甲烷振搖提取3次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，40 ℃以下減壓蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

1.4 檢測方法學考查

1.4.1 被測成分的線性關系和線性范圍

精密吸取各標準品溶液2～20 μL，按1.2節色譜條件測定峰面積，分別以峰面積為因變量(y)，標準品進樣量為自變量(x)，繪制標準曲線，擬合回歸方程。

1.4.2 精密度實驗

精密吸取各標準品溶液，重復進樣6次，每次10 μL，考查測定方法的精密度。

1.4.3 穩定性實驗

取同一標準品溶液，室溫下放置，分別在0、1、4、6、12、24 h進樣10 μL測定，檢測樣品穩定性。

1.4.4 重復性實驗

取同一批紅豆杉樣品6份，依前述實驗條件測定10-DAB、10-DAT、巴卡亭Ⅲ、三尖杉寧堿、紫杉醇含量，檢測方法的重復性。

1.4.5 加標回收率實驗

取已知含量的紅豆杉樣品，分別添加10-DAB、10-DAT、巴卡亭Ⅲ、三尖杉寧堿、紫杉醇標準品適量，同前述條件，進行測定。

2 結果與分析

2.1 方法檢測性能

2.1.1 標準品與樣品的色譜圖

5種紫杉烷類化合物標準品和樣品的色譜圖如圖1所示。可以看出，本文方法下各供試紫杉烷類化合物出峰良好，適用于樣品檢測。

2.1.2 被測成分的線性關系和線性范圍

如表1所示，在本實驗條件下，以進樣量10 μL計算，10-DAB、巴卡亭Ⅲ、10-DAT、三尖杉寧堿、紫杉醇分別在4.25～25.51、5.36～16.08、5.40～14.40、11.40～34.20、4.33～25.97 μg·mL-1內線性良好，決定系數(R2)均在0.999以上。

表1 被測成分線性關系和線性范圍

1，10-DAB；2，10-DAT；3，巴卡亭Ⅲ；4，三尖杉寧堿；5，紫杉醇。a、c，標準品；b、d，樣品圖1 標準品與樣品的色譜圖

2.1.3 檢測方法的精密度

精密度實驗結果顯示，各標準品峰面積相對標準偏差：10-DAB為0.2%，巴卡亭Ⅲ為0.5%，10-DAT為0.6%，三尖杉寧堿為2.3%，紫杉醇為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 檢測方法的穩定性

穩定性實驗結果顯示，各標準品相對標準偏差：10-DAB為1.4%，巴卡亭Ⅲ為0.3%，10-DAT為0.4%，三尖杉寧堿為0.7%，紫杉醇為1.4%，表明儀器精密度良好，標準品溶液在室溫下比較穩定。

2.1.5 檢測方法的重復性

重復性實驗結果顯示，各成分含量相對標準偏差：10-DAB為4.4%，巴卡亭Ⅲ為3.0%，10-DAT為1.8%，三尖杉寧堿為3.7%，紫杉醇為1.3%，表明本方法的重復性較好。

2.1.6 加標回收率

加標回收率實驗結果顯示，10-DAB、巴卡亭Ⅲ、10-DAT、三尖杉寧堿、紫杉醇的加標回收率分別為98.9%、93.3%、96.2%、91.4%、99.7%，相對標準偏差分別為1.0%、1.4%、2.1%、2.4%、0.9%。

綜合上述各項指標可知，本文方法符合相關檢測要求，可用于檢測紅豆杉中5種紫杉烷類化合物的含量。

2.2 紅豆杉中紫杉烷類化合物含量對比

5種紅豆杉屬植物枝葉中紫杉烷類成分的含量見表2。不同種紅豆杉中紫杉烷類化合物含量有較大差異。紫杉醇含量以東北紅豆杉最高，曼地亞紅豆杉次之，且二者的含量遠高于其他品種，是含量最低的西藏紅豆杉的10余倍。10-DAB含量曼地亞紅豆杉最低，不至其他品種的一半，其他品種含量相近。巴卡亭Ⅲ含量差異較大，以云南紅豆杉含量最高，東北紅豆杉略低，二者的含量遠高于其他品種。三尖杉寧堿含量以東北紅豆杉最高，曼地亞紅豆杉次之，其他品種含量較低。10-DAT含量普遍較低，最高的為東北紅豆杉，最低的為西藏紅豆杉。5種紫杉烷類化合物總含量以東北紅豆杉最高，曼地亞紅豆杉、云南紅豆杉和南方紅豆杉含量相近，西藏紅豆杉最低。

表2 不同品種紅豆杉枝葉中紫杉烷類

綜合各成分來看，東北紅豆杉最具開發利用價值，曼地亞紅豆杉作為我國20世紀末引種的雜交品種，其紫杉醇含量相對較高，也具有較高的開發利用價值。

3 小結

本文建立起5種紫杉烷類化合物的含量檢測方法，并對西藏紅豆杉、云南紅豆杉、南方紅豆杉、東北紅豆杉、曼地亞紅豆杉中5種紫杉烷類化合物含量進行測定。結果表明，紫杉醇和三尖杉寧堿含量以東北紅豆杉最高，曼地亞紅豆杉次之；10-DAB含量以曼地亞紅豆杉最低，不到其他品種的一半；巴卡亭Ⅲ含量以云南紅豆杉最高，東北紅豆杉略低；10-DAT含量普遍較低。5種紫杉烷類化合物總含量以東北紅豆杉最高，曼地亞紅豆杉、云南紅豆杉和南方紅豆杉含量相近，西藏紅豆杉最低。綜合來看，東北紅豆杉和曼地亞紅豆杉較具開發利用價值。