對羥基苯甲醇對小白菜天麻素積累和生長的影響

易懷錕，江靈敏，何彥，劉鵬，李笑，張玉蓉，譚朝陽b*，徐德宏b*

(湖南中醫藥大學a藥學院生物工程實驗室，b生物轉化實驗室，湖南 長沙 410208)

天麻素(化學名：4-羥甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，Gastrodin)及其苷元(對羥基苯甲醇)是天麻塊莖中兩種主要的有效成分[1]，具有鎮靜、催眠、鎮痛、增強免疫等作用，在臨床上廣泛用于治療心腦血管、微循環系統疾病，對頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風、癲癇、抽搐、破傷風等病癥有顯著療效且無明顯副作用[2-5]。天麻是提取天麻素的主要來源，但野生資源匱乏且含量較低，故有必要采用其他方法來獲取天麻素。目前，在人工栽培方面雖取得了進展，但由于天麻種植所需生長環境的條件苛刻，以及栽培過程中天麻品質逐漸降低的問題，導致天麻素原料的大量供應很難保證[6-7]。除此之外，還有其他方法可以合成天麻素，例如植物組織或細胞培養法[8-11]、化學合成法[12-14]等。其中，組織和細胞培養法通過優化培養基條件和添加前體物質來提高產量和收率，但周期長、成本高。由于天麻素含葡萄糖基，化學合成法需要經過多步的保護和去保護措施，過程復雜且成本高，副產物較多且難于分離，因此以上這些方法均未能用于天麻素的大規模生產。

小白菜原產于我國，具有栽培成本低廉、栽培技術簡單且栽培面積廣泛等特點，是一種廣受人民喜愛的蔬菜，其營養成分主要有可溶性糖、可溶性蛋白、纖維素、維生素C等[15]。葡萄糖基轉移酶在植物體內普遍存在，是催化底物發生糖基化的酶[16-17]，但多數植物在自然條件下不能自發產生對羥基苯甲醇，因而也就不含天麻素。本研究試圖通過水培法對不含天麻素的小白菜直接體外供給對羥基苯甲醇，研究對羥基苯甲醇對小白菜生長和天麻素積累的影響，為今后既經濟又高效地大規模利用小白菜水培生成天麻素，并進一步開發成為一種保健蔬菜奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Agilent 1260 HPLC-6530 Accurate-Mass Q-TOFLC/MS液質聯用儀；日本島津LC-10ATvp高效液相色譜儀。天麻素對照品：中國食品藥品檢定研究院，批號為11807-200205；對羥基苯甲醇：武漢金諾化工有限公司，批號為SH0530；甲醇、乙腈為色譜純，其余均為分析純。小白菜種子(南京秋田種業研究所，檢疫證明編號：3201000020100106)由湖南中醫藥大學譚朝陽教授購于湖南省長沙市望城市場。

1.2 方法

1.2.1 營養液配制

采用的營養液配方為華南農業大學葉菜配方。大量元素配方：A液含Ca(NO3)2·4H2O 472 mg·L-1、KNO3202 mg·L-1、NH4NO380 mg·L-1；B液含KH2PO4100 mg·L-1、K2SO4174 mg·L-1、MgSO4·7H2O 246 mg·L-1。將大量元素的各種化合物擴大400倍后用電子天平稱量，并分別用蒸餾水溶解配成A液和B液的母液。微量元素配方(C液)：FeSO4·7H2O 27.8 mg·L-1、EDTA-2Na 37.2 mg·L-1、H3BO32.86 mg·L-1、MnSO4·4H2O 2.13 mg·L-1、ZnSO4·7H2O 0.22 mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.08 mg·L-1、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.02 mg·L-1，將各化合物稱量擴大1 000倍，用電子天平稱取后混合在一起溶解并裝在棕色儲器內。使用時分別取大量元素A母液和B母液各25 mL加入6 L水中，邊加邊攪拌直到沒有沉淀之后，加入微量元素母液10 mL并定容至10 L。

1.2.2 處理設計

將正常生長的小白菜按每組12株分為A、B、C、D共4組，A組為對照組，營養液中不加對羥基苯甲醇，B、C、D組為實驗組，分別在營養液中添加1、2、3 mmol·L-1對羥基苯甲醇。以上4組小白菜在25 ℃恒溫玻璃大棚中培養，每隔6 d更換一次含相應濃度對羥基苯甲醇的營養液，同時采收3株小白菜，記錄每株小白菜的株高和根長，并按以下方法進行天麻素含量測定。首先，每株小白菜取10 g葉片剪碎，加入50%甲醇10 mL，精密稱量后加熱回流1 h，用50%甲醇補足加熱回流損失的質量，并用濾紙過濾后取過濾液作為供試品溶液。其次，精密稱量天麻素標準品和對羥基苯甲醇標準品，分別加入50%甲醇制成每1 mL中含0.05 mg的標準品溶液，并按1∶1混合后用于色譜檢測。最后，用0.45 μm微孔濾膜過濾供試品溶液和標準品溶液，進行HPLC檢測，根據兩者檢測得到的色譜峰面積換算供試品溶液中天麻素的含量。色譜檢測條件：Agilent 20RBAX C18柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm particle size)，流速1 mL·min-1，流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液(體積比3∶97)，檢測波長為220 nm，柱溫為40 ℃，進樣量為20 μL。

1.2.3 天麻素的液相色譜質譜聯用(LC-MS)檢測

為進一步確定轉化產物是天麻素，將1.2.2節制備的供試品溶液進行LC-MS檢測。其中色譜檢測條件為Agilent ZORBAX Bonus-RP色譜柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)，流動相為甲醇-0.1%甲酸溶液(體積比6∶94)，檢測波長為220 nm，流速為0.5 mL·min-1，進樣量為10 μL，柱溫為40 ℃。質譜檢測條件為電噴霧正離子模式，霧化氣溫度為325 ℃，干燥氣流速為6 L·min-1，噴霧器壓力為0.28 MPa，鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣流速為12 L·min-1，毛細管電壓為4 000 V，碎裂電壓為110 V，質譜核質比采集50～1 000。

2 結果與分析

2.1 小白菜轉化對羥基苯甲醇生成天麻素的色譜檢測

HPLC檢測結果(圖1)表明，在小白菜水培營養液中添加前體物質對羥基苯甲醇后，葉片甲醇提取物中存在天麻素和對羥基苯甲醇，說明小白菜可通過根系從營養液中吸收前體物質并將其轉運至葉中，然后利用葉肉細胞中的相關糖基轉移酶，催化對羥基苯甲醇發生葡萄糖基化生成天麻素。另外，也說明葡萄糖基轉移酶廣泛分布在植物體內，當有相應前體物質存在時，它們能催化這些前體物質發生糖基化生成糖苷，推測多數植物在自然條件下不能自發產生天麻素，其中一個重要原因與自身不能合成對羥基苯甲醇有關。

A，天麻素和對羥基苯甲醇標準品的色譜圖。將兩種標準品按1∶1混合后進行色譜檢測，保留時間14.461 min的峰為天麻素標準品，保留時間28.629 min的峰為對羥基苯甲醇。B，小白菜甲醇提取液的色譜圖，保留時間14.469 min的峰為小白菜轉化生成的天麻素，保留時間28.744 min的峰為小白菜吸收的對羥基苯甲醇經轉化后在葉片中的殘留物圖1 小白菜轉化對羥基苯甲醇生成天麻素的色譜檢測結果

2.2 小白菜轉化對羥基苯甲醇生成天麻素的質譜鑒定

對小白菜HPLC圖中與天麻素標準品具有相同保留時間的色譜峰進行質譜檢測，結果(圖2)顯示，此峰所含物質可與溶液中H+、NH4+、Na+、K+形成不同的復合物，所得一級質譜的核質比(m/z)分別為287.115 9、304.139 2、309.094 4、325.068 1。減去以上結合離子的分子量后，所得數值與天麻素理論分子量286.277 8 u相同，表明小白菜轉化得到的峰含有天麻素，并進一步證實小白菜體內含有可以將對羥基苯甲醇轉化成天麻素的糖基轉移酶。

圖2 小白菜轉化對羥基苯甲醇生成天麻素的質譜鑒定結果

2.3 對羥基苯甲醇和培養時間對小白菜積累天麻素的影響

結果(圖3)顯示，添加不同濃度對羥基苯甲醇后，小白菜體內均能合成天麻素，而且在第6天時小白菜轉化生成天麻素的含量最高，此后隨著培養時間的延長，天麻素在小白菜體內的含量則逐漸降低。另外，隨對羥基苯甲醇濃度的增加，小白菜在第6天轉化生成天麻素的量也逐漸增加。以上研究結果可以說明兩個問題，一是小白菜對前體物質的轉化具有一定的濃度依賴性，即前體物質濃度的增大會導致天麻素轉化量也隨之增大；二是小白菜對天麻素的積累受時間長短的影響，在以后大規模水培小白菜獲取天麻素時，要注意小白菜采收時間，同時還要進一步尋找其他方法來延緩或阻斷天麻素在小白菜體內的消耗。另外，根據天然狀態下小白菜不含天麻素這一基本事實，推測出現以上天麻素逐漸被消耗的原因，可能與天麻素作為一種小白菜非必須次生代謝物有關，因為當天麻素在小白菜體內產生之后，為了滿足自身營養所需，小白菜會繼續代謝天麻素生成其他營養物質，從而導致天麻素難以在小白菜中長期積累。

A組為采用水培方式不加對羥基苯甲醇的對照組，B、C、D組為采用水培方式分別添加1、2、3 mmol·L-1對羥基苯甲醇的實驗組。每組結果均來自3株水培小白菜，以平均數±標準差的方式進行表示。圖4同圖3 不同濃度對羥基苯甲醇和培養時間對小白菜積累天麻素的影響

2.4 對羥基苯甲醇對小白菜生長的影響

水培植物時，營養液中物質成分的變化會直接影響植物的生長狀況。本實驗添加的前體物質對羥基苯甲醇為小白菜生長非必須物質，通過測量根長和株高來反應對羥基苯甲醇對小白菜生長狀況的影響。圖4顯示加入對羥基苯甲醇后，小白菜的平均根長在前12 d內逐漸增大，但12 d后由于老根逐漸死亡而出現平均根長開始變短的現象。根作為植物吸收營養物質一個重要器官，其生長好壞會直接影響整個植株個體特別是株高的生長狀況。在水培前18 d小白菜的平均株高都在增長，但18 d后其平均株高則停止生長，這一現象與對照組形成了鮮明對比。綜合可知，對羥基苯甲醇作為營養液添加物質對小白菜生長有害，這與酚類物質對其他植物生長有負面影響相同[18-20]，但小白菜能在較短時間和一定濃度范圍內抵抗對羥基苯甲醇的危害，而且這種抵抗能力與對羥基苯甲醇濃度和施加時間呈負相關，可為進一步探討合適濃度的對羥基苯甲醇用于大量積累天麻素提供依據。

圖4 不同濃度對羥基苯甲醇和培養時間對小白菜生長的影響

3 小結

本研究利用水培小白菜的方法，成功實現了對羥基苯甲醇轉化生成天麻素的目標，并初步了解到小白菜能在較短時間和一定濃度范圍內抵抗對羥基苯甲醇的危害，以上研究結果為日后深入研究如何大規模水培小白菜生成天麻素，并將其商業化生成保健蔬菜奠定了基礎。