豬肝酯酶雜化“納米花”的制備及其對菊酯類農藥的水解性能研究

彭開敏，葉 泰，曹 慧，袁 敏，于勁松，徐 斐

(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海食品微生物工程研究中心，上海 200093)

擬除蟲菊酯類農藥是人工合成的一類高效、廣譜、神經致毒性仿生殺蟲劑[1]，廣泛應用于防治蔬菜、棉花、果樹、花卉害蟲[2]。但其殘留會導致生物體中樞神經系統嚴重損害。因此，新型擬除蟲菊酯類農藥殘留的快速檢測方法研究受到了廣泛關注[3]。目前，對于擬除蟲菊酯類農藥殘留的快速檢測通常基于酯鍵水解建立針對水解產物中氰基或間苯氧基苯甲醛及其衍生物的檢測方法[4]。但嚴苛的水解條件(強堿性試劑)和水解產物的不確定性，在一定程度上限制了擬除蟲菊酯類農藥快速檢測方法的應用[5-6]。

羧酸酯酶能夠專一地水解擬除蟲菊酯類農藥[7-8]，且水解條件溫和、操作簡便[9]，在酶法農藥快速檢測領域顯示出巨大的潛力和優越性[10]。但是，通過濕法固定的羧酸酯酶表觀活性較低，水解產物得率偏低，限制了酶水解方法快速檢測擬除蟲菊酯農藥的靈敏度[11]。而近年來出現的有機-無機雜化納米材料可有效地解決該問題。Zare等[12]首先提出了一種基于金屬離子的鹽溶液合成含酶雜化“納米花”的新方法，其生物催化實驗[13]證實納米花結構能夠有效提高酶分子的體外催化活性和催化穩定性[14]。基于此，Ke等[15]將鈣離子作為無機成分和脂肪酶制備脂肪酶納米花，其活性比游離脂肪酶高308%，且制成的脂肪酶納米花的儲藏穩定性更高；Ye等[16]利用轉氨酶和鈣離子制備的轉氨酶雜化納米花裝載了足夠的轉氨酶并增強了轉氨酶的活性，所制備的納米花也是一種兼具生物識別和信號放大功能的標記物，在病原微生物的檢測方面有廣闊的應用前景。Zhao等[17]利用α-乙酰乳酸脫羧酶和鈣離子合成了α-乙酰乳酸脫羧酶納米花，并用于消除啤酒異味、縮短啤酒熟化時間，在啤酒釀造行業具有很大的應用潛力。

本文制備了基于豬肝酯酶(PLE)的雜化“納米花”，通過優化不同的制備參數獲得最優制備條件，采用紅外光譜、掃描電鏡和元素能譜分析對豬肝酯酶雜化“納米花”進行表征，并研究了該“納米花”對4種菊酯農藥的水解性能?；贑a3(PO4)2-PLE雜化納米花對擬除蟲菊酯類農藥的高效水解，制作酶水解型傳感器，有望為進一步探究擬除蟲菊酯類農藥殘留的快速檢測方法提供新的途徑和思路。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

豬肝酯酶(PLE，Novocata公司)；氰戊菊酯、甲氰菊酯等菊酯類農藥(上海農藥研究所)；氯化鈣、海藻酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙腈、十二烷基硫酸鈉(SDS)及其他試劑(上海國藥化學試劑有限公司)；所有試劑均為分析純，實驗用水為雙蒸水。

TU-1901型可見分光光度計(北京普析公司)；Waters1525高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；Sepax HP-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm，美國賽分公司)；Quanta F250式熱場掃描電鏡(美國FEI公司)；S4800式冷場掃描電鏡(日本日立公司)；iS5傅立葉紅外掃描儀(美國Nicolet公司)；ZDDN-Ⅱ自動型凱氏定氮儀(浙江托普公司)。

1.2 Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的制備

通過共沉淀法合成“納米花”[18]：首先在磷酸鹽緩沖溶液(10mmol/L，pH7.4)中制備質量濃度為0.3g/L的PLE溶液，再將90μL CaCl2溶液(500mmol/L)加至6mL上述PLE溶液中，于20℃下孵育12h。離心(12000r/min，10min)收集沉淀，用水洗滌3次以除去非特異性吸附的蛋白，儲藏于4℃冰箱中待用。

1.3 液酶與Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花活性的測定

液酶的酶活測定根據文獻方法[19]改進：將液酶用2mL檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(pH6.4)振蕩懸浮后，用雙蒸水稀釋3000倍。在3mL稀釋酶液中加入50μL底物(16mmolα-乙酸萘酯的丙酮溶液)混合均勻，在30℃下孵育5min，然后與0.5mL顯色劑(0.4%固蘭B的1.8%SDS溶液)混合均勻，再于30℃下保溫5min。以不加底物(α-乙酸萘酯)的反應液作空白，測定595nm處的吸光度值。在上述條件下，每分鐘豬肝酯酶催化該反應體系，使其在595nm處的吸光度值升高1所需的酶量定義為豬肝酯酶活力。根據下式計算液酶的活力[20]：

式中：U為酶活力(U/mg)；A為酶解底物的吸光度；A0為對照組的吸光度；V為酶解體系的總體積(mL)；t為反應時間(min)；n為稀釋倍數；m為酶中蛋白質的質量(mg)[21]。

Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花酶活的測定：通過凱氏定氮儀測定Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的實際蛋白含量，取與上述液酶相同蛋白含量的雜化納米花，用2mL檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(pH6.4)振蕩懸浮后，用雙蒸水稀釋3000倍。采用與液酶相同的測定方法及公式對其酶活進行測定。

1.4 Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花水解菊酯類農藥

取66μL菊酯類農藥(100mg/L)溶于1.25mL 緩沖液中(農藥質量濃度為5mg/L)，加入由1.8mg豬肝酯酶制成的Ca3(PO4)2-PLE納米花，置于47℃水浴中反應20min，加入160μL四氯化碳旋渦振蕩5min后靜置分層，取下層四氯化碳提取液40μL，氮氣吹干并加入40μL乙腈復溶，用液相色譜對水解產物進行測定。

液相色譜條件：色譜柱為Sepax HP-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相為0.1%(體積分數)乙酸水溶液-乙腈(21∶79)，流速1.1mL/min；檢測波長225nm，柱溫25℃，進樣量20μL。

2 結果與討論

2.1 Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的制備及表征

2.1.1Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的制備將氯化鈣溶液加入含有豬肝酯酶的磷酸鹽緩沖液中，孵育12 h，得到白色絮狀沉淀，即磷酸鈣納米晶體和豬肝酯酶自組裝形成的Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花。如圖1所示，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的合成包括豬肝酯酶與磷酸鈣晶體的聚集成核階段、生長階段和組裝成納米花3個階段。其中，成核階段起著關鍵作用[17]。而Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的形成可由其組成成分以及結構特征等因素反映，因此需對Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花作進一步表征[18]。

圖1 豬肝酯酶雜化“納米花”的合成示意圖Fig.1 General diagrammatic illustration of synthesis of Ca3(PO4)2-PLE hybrid nanoflowers

采用掃描電鏡(SEM)對制備的Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花進行形貌觀察(圖3)。由電鏡圖片可知，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的平均尺寸約為20 μm，呈圓形并由多層片層構成花瓣狀，因此具有較高的比表面積，這可能是雜化納米花酶比液酶具有更高酶活的原因之一。

2.2 制備條件的優化

Somturk等[22]的研究表明，不同的酶濃度和金屬離子濃度均會影響雜化納米花的表觀酶活力?？疾炝素i肝酯酶的質量濃度對Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花形成的影響，發現豬肝酯酶的質量濃度為0.3 g/L 時雜化納米花的酶活最高(圖4A)，隨著豬肝酯酶質量濃度的升高或降低，酶活力均降低，這可能是由于在相對高濃度的酶中，納米花所有的花瓣嚴格地彼此嵌入，并且表面無空隙結構，而中等濃度的豬肝酯酶則能合成具有孔隙結構的相當均勻的球形雜化納米花。當豬肝酯酶的質量濃度較低時，納米花不能形成片層狀結構[23]。因此，選擇豬肝酯酶的質量濃度為0.3 g/L。

鈣離子濃度也會影響Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的結構(圖4B)，這是因為在合適的Ca2+濃度(500 mmol/L)時，會形成較為均一穩定的雜化納米花結構，而在較低的Ca2+濃度下，則不會形成雜化納米花的結構，且當Ca2+濃度低至250 mmol/L時，酶活明顯較低，隨著Ca2+濃度升至500 mmol/L，酶活達到最高。之后，繼續提高Ca2+濃度，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的酶活逐漸下降并在Ca2+濃度高于1 000 mmol/L時達到平穩，原因可能是過高的氯化鈣濃度使Ca2+濃度相對豬肝酯酶達到飽和，不會參與到Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的形成過程。

磷酸鹽緩沖液濃度(5、10、20、30、40、50 mmol/L)、pH值(pH 6.0、7.4、8.0、9.0、10.0)以及溫度對納米花形成的形態影響不大，但對其酶活性仍有一定的影響。磷酸鹽緩沖液的濃度為10 mmol/L時，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的酶活達到最高，過高的磷酸鹽濃度會抑制Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的活力。在pH 7.4和20 ℃時，合成的Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花具有最高的酶活。

2.3 酶活對比及對不同菊酯類農藥的水解情況

在最優條件下，測定Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花和游離酶的酶活，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花酶活為液酶的169%(圖5A)。這可能是因為：Ca3(PO4)2-PLE納米花的顆粒較小，比表面積大且表面具有較多的空隙結構，這些空隙可以增加酶和底物的接觸面積；此外，納米級包埋和豬肝酯酶的協同效應以及豬肝酯酶在Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花中形成的酶構象也綜合提高了Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的酶活[22，24]。

采用合成的Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花對氰戊菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯進行水解(圖5B)，同時與液酶的水解情況進行對比，發現Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花對上述4種農藥的水解效果均優于液酶。但對于不同種類的菊酯類農藥，納米花的水解效率不同，其中水解效果最好的氰戊菊酯比水解效果最差的氟氯氰菊酯的水解效率高26%，底物特異性的差異表明固定的Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花對于不同的擬除蟲菊酯類農藥可能具有不同的適用性。

2.4 Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的循環使用性

為進一步驗證Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的可重復利用性，本實驗選取氰戊菊酯進行循環水解實驗。結果表明，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花在第2次循環仍保持70%以上的回收效率。隨著循環次數的增加，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的殘留活性逐漸降低，6次循環反應后其活性僅為10%，這可能是由于每次循環后Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花在離心分離過程中的質量損失所致。在實際應用過程中，可考慮選擇載體對Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花進一步固定，避免因循環過程中酶的質量損失而導致酶活降低。

3 結 論

本文表征了由Ca2+離子和豬肝酯酶合成的Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的組成和形貌，并對其合成條件進行了優化。同時研究了該Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花在水解擬除蟲菊酯類農藥方面的應用，結果顯示，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花對Ⅰ型(氯菊酯)、Ⅱ型擬除蟲菊酯(氰戊菊酯、甲氰菊酯、氟氯氰菊酯)類農藥均有較好的水解效果。與游離豬肝酯酶相比，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花顯示出更高的酶活性和重復利用能力，在基于酶法檢測菊酯類農藥的樣品前處理方面顯示了巨大的應用前景。今后可利用Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花設計酶水解型傳感器，即基于Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花對擬除蟲菊酯類農藥的良好水解能力，由得到的水解產物向相應的裝置提供檢測信號，再利用轉換器將檢測信號轉換成可定量分析的光、電信號，從而實現擬除蟲菊酯類農藥的定量檢測。