共價有機聚合物固相萃取/高效液相色譜法測定面粉中3種熒光增白劑

丁 惠，紀文華，賀吉香*

(1.山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.齊魯工業大學(山東省科學院)，山東省分析測試中心，山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南 250014)

熒光增白劑(FWAs)是一種具有復雜化學結構的熒光染料，由于其在吸收不可見紫外光(290～400nm)的同時可以發射比入射光范圍更廣的可見光(400～480nm)，所以能夠提高基質的白度和亮度[1]。當前，FWAs被廣泛應用于造紙、洗滌劑、塑料、紡織纖維等產品中，以達到增白增艷的效果[2]。為追求經濟利益，一些不法商家將FWAs添加到食品及其包裝材料中以提高產品的外觀，吸引消費者。FWAs在人體內會與人血清蛋白結合，進入血液循環系統，而FWAs特殊的穩定結構導致其難以通過新陳代謝正常排出體外，從而在體內蓄積危及人類健康[3]。此外，FWAs會阻礙傷口愈合，且一旦在體內蓄積過量，將成為潛在的致癌因素[4]。國家標準GB/T27741-2011和GB31604.47-2016中規定了紙制品和食品接觸材料中相關FWAs的檢測方法及檢出限，衛生部《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單(第四批)》明確指出面粉中的熒光增白劑為違法添加的非食用物質。因此迫切需要建立一種高效便捷的食品中FWAs的檢測方法。目前，FWAs的檢測方法主要有熒光分光光度法[5]、紫外分光光度法[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7]以及液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)[8-9]。鑒于樣品基質復雜，成分多樣，且基質中FWAs的添加水平較低，因此選擇合適的前處理方法實現對目標分析物的有效富集十分重要。

固相萃取(SPE)作為目前廣泛應用的一種樣品前處理方法，在食品檢測[10]、環境監測[11]、生物樣品分析[12]等領域發揮著重要作用。SPE能有效避免大量有機溶劑的使用，同時具有基質效應小、操作方便等優點，可在短時間內實現對目標分子的快速富集[13-15]。除了傳統的C18、硅膠、氧化鋁和氨基等固相萃取填料外，金屬有機框架材料、氧化石墨烯、碳納米管等新興材料由于具有良好的吸附性能和較高的穩定性而得到廣泛關注[16-19]。本文選擇三氯化鉍作為催化劑，使2,4,6-三羥基-1,3,5-苯三甲醛和2,6-二氨基吡啶在低溫下聚合成一種具有良好吸附性能的共價有機多孔聚合物(COPs)。將COPs成功應用于固相萃取填料，基于此建立了熒光增白劑的高效液相色譜檢測方法，該方法具有較好的檢測靈敏度和準確性，能夠用于實際樣品的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

傅立葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet儀器公司);JW-BK132F型比表面積測定儀(北京精微高博科學技術有限公司);固相萃取裝置(美國Supelco公司);Waters e2695高效液相色譜儀，配2998二極管陣列檢測器及Empower3色譜工作站(美國Waters公司);超純水由Milli-Q系統制得(美國Millipore公司)。

圖1 3種熒光增白劑的化學結構式Fig.1 Molecular structures of three FWAs

1.2 COPs的制備

在50mL圓底燒瓶中加入0.63g TFP和0.22g2,6-DAP，加入14mL1,3,5-三甲基苯和二氧六環(6∶1，體積比)的混合溶劑，再加入0.013g BiCl3，超聲10min后密封，置于室溫下聚合反應8h。離心除去上清液，所得反應產物用濾紙包裹置于索氏提取器中，以甲醇-三氟乙酸(9∶1，體積比)回流24h除去未反應的原料，再用甲醇洗至中性，真空干燥24h。研磨后得到褐色產物，避光保存。

1.3 等溫吸附實驗

稱取10mg COPs加至10mL螺口玻璃瓶中，然后加入2.5mL系列質量濃度的3種FWAs標準溶液(1～60mg·L-1)，室溫振蕩120min后，離心去除聚合物，上清液過0.45μm濾膜并采用HPLC測定。聚合物的平衡吸附量(Qe,mg·g-1)由下式計算得到：Qe=(Ci-Ce)V/m，其中，Ci(g·L-1)和Ce(g·L-1)分別為FWAs的初始質量濃度和吸附達平衡時的質量濃度；V(mL)為標準溶液體積；m(mg)為聚合物的質量。

1.4 吸附動力學實驗

將10mg COPs加至10mL螺口玻璃瓶中，然后加入2.5mL50mg·L-1的FWAs標準溶液，室溫下振蕩3～80min，離心后取上清液，過0.45μm濾膜并采用HPLC測定，以考察聚合物對目標分析物的傳質速率。

1.5 液相色譜條件

色譜柱：Symmetry?C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱溫：25℃；進樣量：10μL；檢測波長：370nm；流速：1.0mL·min-1；流動相：A為甲醇，B為0.1%三氟乙酸水溶液，梯度洗脫程序：0～4min，94% A；4～5min，94%～91% A；5～16min，91%A。

1.6 實際樣品的制備

實驗用面粉均購自濟南當地超市、市場和糧油店。精密稱取1.0000g樣品于100mL錐形瓶中，以50mL 氯仿超聲提取30min，離心后，取上清液用氯仿定容至50mL，待測。

2 結果與討論

2.1 COPs的制備

相較于傳統的高溫聚合方法，本實驗借鑒Matsumoto等[20]的研究，采用低溫聚合的方法使單體快速聚合。考察了原料的不同配比對聚合物吸附容量(Qe)的影響。結果顯示，當TFP和2,6-DAP的摩爾比為3∶2時，Qe達最大值(0.28mg·g-1)，隨著原料中2,6-DAP的增多，Qe有所下降。同時評價了另外3種催化劑(Sc(OTf)3、InCl3.4H2O、TsOH)所制聚合物的吸附能力，得到其Qe分別為0.11、0.14、0.06mg·g-1，均低于BiCl3催化下形成的COPs對目標分析物的吸附容量(0.28mg·g-1)，因此實驗最終選擇BiCl3作為合成COPs的催化劑。

2.2 COPs的性能表征

2.2.1比表面積根據BET氮氣吸附等溫線評價COPs的物理特性，測得COPs的比表面積為271 m2·g-1，相應的孔穴體積為0.120 m3·g-1，表明COPs具有多孔性，從而具有較大的吸附容量。根據IUPAC分類，COPs的N2吸附等溫線的形狀可歸屬于Ⅳ型等溫線，推斷聚合物為介孔類吸附劑材料。

圖2 COPs的紅外光譜Fig.2 FT-IR spectra of COPs

2.3 等溫吸附實驗

利用等溫吸附實驗測定COPs對FWA 367、FWA 368和FWA 393的吸附量(圖3A)，結果顯示，COPs的吸附量隨著FWAs質量濃度的增大而增加。當FWA 368、FWA 367和FWA 393的初始質量濃度分別超過40、30、30 mg·L-1時，COPs對目標化合物的平衡吸附量不再變化，此時達到飽和吸附容量。

選擇Freundlich和Langmuir吸附模型評估COPs對3種FWAs的吸附性能，結果見表1，KF和KL分別為兩方程的平衡常數，n為吸附強度，Qm為理論最大吸附量。根據計算結果可知，Freundlich吸附模型與數據的擬合關系更好(r2≥0.921)；n>1，表明COPs對FWAs的吸附存在多種不同的結合位點，具有良好的吸附性能。

表1 COPs吸附FWAs的Freundlich和Langmuir吸附模型Table 1 Freundlich adsorption models and Langmuir isotherm models for FWAs onto COPs

*ydenotes lgQe，xdenotes lgCe;**ydenotesCe/Qe,xdenotesQe

2.4 吸附動力學實驗

計算不同時間內聚合物對50 mg·L-1FWA 367、FWA 368和FWA 393的吸附容量，可得到COPs對FWAs的動態吸附曲線(圖3B)，COPs對3種FWAs具有較高的傳質速率，FWA 367、FWA 368和FWA 393分別在30、40、35 min達到最大吸附量。

吸附動力學數據分別用Lagergren準一級動力學模型和準二級動力學模型進行擬合分析(表2)，其中k1和k2分別為兩方程的吸附速率常數，Qe分別由實驗和擬合方程得出。由表2可知，準一級動力學模型的擬合相關系數(r2≥0.868)相對較高，且由準一級動力學模型得到的平衡吸附量與實驗值更為接近，故準一級動力學模型更適用于本實驗的動力學數據分析。

表2 COPs吸附FWAs的準一級動力學模型和準二級動力學模型Table 2 Pseudo-first order kinetic model and pseudo-second order kinetic model for FWAs onto COPs

2.5 固相萃取(SPE)條件的優化

通過3種熒光增白劑在氯仿、乙酸乙酯、丙酮、四氫呋喃、甲醇、乙腈等不同有機溶劑中的溶解性實驗發現，氯仿可以較好地溶解FWA 367、FWA 368和FWA 393，因此選用氯仿作為樣品萃取溶劑及SPE上樣溶劑。

2.5.1吸附劑的用量將40～150 mg聚合物分別裝填到1 mL的固相萃取小柱中，考察不同吸附劑用量對3種熒光增白劑的吸附效果。結果顯示，當吸附劑用量為100 mg時，FWA 367、FWA 368和FWA 393的回收率分別為97.2%、98.4%和94.1%。當吸附劑用量小于100 mg時，回收率降至90%以下；而當吸附劑用量高于100 mg時，上樣流速降低，分析時間延長。因此實驗確定吸附劑的最佳用量為100 mg。

2.5.2流速的優化實驗表明，當上樣流速為1～5 mL·min-1時，3種熒光增白劑的回收率均大于90%；當流速增至6 mL·min-1時，FWA 367、FWA 368和FWA 393的回收率分別降至72.3%、81.5%和76.7%。綜合考慮分析時間和回收率，最終確定流速為5 mL·min-1。

2.5.3洗脫劑的優化分別選用甲醇-三氟乙酸(9∶1)、氯仿-甲醇-三氟乙酸(6∶3∶1)和氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)作為洗脫劑，考察了不同體積比的洗脫劑對FWAs的洗脫能力，同時考察了不同體積(1～9 mL)的洗脫劑對目標化合物回收率的影響。結果表明，以5 mL的氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)為洗脫劑時，FWA 367、FWA 368和FWA 393的回收率分別為98.2%、101%和98.7%，因此實驗選用5 mL的氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)作為洗脫劑。

2.6 方法學驗證

將3種FWAs標準溶液逐步稀釋，得到質量濃度分別為1、10、20、30、40、60、70、80、90、100 μg·L-1的標準溶液。在最優固相萃取條件下，洗脫液經HPLC依次測定，3種FWAs在1～100 μg·L-1范圍內具有良好的線性關系(r2≥0.996 2)。以3倍信噪比(S/N=3)時的質量濃度作為方法的檢出限(LOD)，S/N=10時的質量濃度為定量下限(LOQ)，得到3種FWAs的LOD為0.15～0.27 μg·kg-1，LOQ為0.50～0.89 μg·kg-1(見表3)，表明該方法具有較高的檢測靈敏度。

表3 3種FWAs的線性關系、檢出限、定量下限、加標回收率及相對標準偏差Table 3 Linear relationships,detection limits,quantitation limits，recoveries and RSDs of three FWAs

對陰性面粉基質進行3種不同水平(10、30、60 μg·kg-1)FWAs標準溶液的加標回收實驗(n=6)，由表3可知，樣品經SPE富集后，3種FWAs的回收率為81.2%～102%，相對標準偏差(RSDs)為4.3%～12.7%。

相比于其他文獻方法(表4)，本方法具有較低的檢出限和定量下限，同時樣品前處理方法簡單，有機溶劑用量少，具有相對較高的回收率，結果準確，能夠實現面粉中熒光增白劑的定性定量檢測。

表4 樣品中熒光增白劑的檢測方法比較Table 4 Comparison of the proposed method with other methods for the determination of FWAs in samples

2.7 與商用SPE填料的比較

對比了C18、硅膠(Silica)、硅酸鎂(Florisil)和中性氧化鋁(Alumina N)為吸附填料的商用SPE柱和COPs固相萃取對3種FWAs的吸附能力。圖4A為上述5種SPE填料在首次使用時對3種FWAs的回收率，其中COPs對FWAs的回收率高達98.8%，明顯優于其他吸附材料。同時，以3種FWAs的平均回收率為響應值，對比了上述SPE柱經吸附-解吸附循環使用后的吸附能力(圖4B)。結果顯示，以COPs為填料的SPE柱經12次循環使用后，回收率仍高達87.8%，而其他幾種填料的回收率已降至60%以下，無法滿足分析檢測的要求。

2.8 實際樣品的應用

將COPs作為吸附劑，以優化后的SPE條件對面粉中的FWAs進行富集，取100 mg的COPs裝填到SPE小柱中，經3 mL甲醇和2 mL氯仿活化后，將樣品溶液以5 mL·min-1通過SPE小柱，然后用5 mL氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)洗脫，洗脫速度為1 mL·min-1，洗脫液用氯仿定容至5 mL后按本方法進行檢測。從超市、市場和糧油店隨機購買10批面粉，經上述最優條件處理后進行檢測，在2份面粉樣品中檢出FWA 393，含量分別為14.2、11.3 μg·kg-1，表明樣品包裝材料中的熒光增白劑發生遷移或不法商家違法添加了熒光增白劑。

3 結 論

本文以TFP和2,6-DAP為單體，BiCl3為催化劑，采用低溫聚合法成功制得具有良好吸附性能的共價有機多孔聚合物。通過BET等溫吸附實驗，發現該聚合物具有較大的比表面積和孔穴體積，能夠用于SPE填料。以COPs吸附劑為填料，建立了熒光增白劑的SPE/HPLC分析技術，方法操作簡單，重現性好，可實現熒光增白劑的快速富集，并成功應用于面粉中3種熒光增白劑的高靈敏檢測。