核磁共振波譜法測定片劑中鹽酸巴馬汀含量

徐 凱，魏永鴿，郝海軍

(1.黃河科技學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450005；2.上海雷允上藥業(yè)有限公司 技術(shù)中心，上海 201401；3.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450052)

隨著核磁共振儀性能的不斷提高及傅立葉變換技術(shù)的應(yīng)用，近年來核磁共振技術(shù)越來越多地應(yīng)用于定量分析領(lǐng)域[1-3]。目前，核磁共振定量法(qNMR)在食品、藥品、農(nóng)藥等領(lǐng)域日益得到關(guān)注。中國、美國、日本及英國等各國藥典均收載了qNMR法。在藥物研發(fā)過程中，qNMR法不僅可準確測定原料藥、中間體及制劑中的藥物含量，還可同時鑒別假冒、偽劣產(chǎn)品，在藥品質(zhì)量控制中發(fā)揮著重要作用[4-6]。

黃藤素即鹽酸巴馬汀，是從防己科植物黃藤FibrurearecisaPierre.的根莖中提取得到的一種季銨型生物堿，具有良好的清熱解毒效果，臨床上主要用于婦科炎癥、腸炎、呼吸道及泌尿道感染等。黃藤素片的質(zhì)量標準收載于《中國藥典》2015年版一部[7]，該標準采用高效液相色譜法測定黃藤素片中的鹽酸巴馬汀含量，薄層色譜法進行鑒別、檢定，但操作過程較為復(fù)雜，費時費力。近年來市場上出現(xiàn)黃藤素片假冒偽劣產(chǎn)品[8]，因此迫切需要建立一種簡單、快速測定黃藤素片中鹽酸巴馬汀含量及鑒別假冒偽劣產(chǎn)品的分析方法。在前期研究的基礎(chǔ)上[9]，本文首先采用NMR法(1H NMR、13C NMR和HSQC譜)對黃藤素片提取物進行定性鑒別，進一步采用qNMR法對提取物進行含量測定。將qNMR法用于黃藤素片的質(zhì)量控制，可實現(xiàn)定量分析與定性鑒別同時進行，且操作簡單，省時省力，為推廣qNMR法應(yīng)用于藥品質(zhì)量控制提供了經(jīng)驗，也為其他藥品的質(zhì)量控制提供了有價值的參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

Bruker AVANCE Ⅲ400型核磁共振儀(瑞士布魯克公司)；分析天平(十萬分之一天平，德國Sartorius公司)；PS-40A型超聲儀(菏澤儀器儀表有限責(zé)任公司)；氘代甲醇(CD3OD，氘代度99.8%，美國Sigma-Aldrich公司)；黃藤素片(批號：20180216、20180422、20180717，云南植物藥業(yè)有限公司)；鹽酸巴馬汀(批號：H-015-130626，含量>98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；馬來酸對照品(含量為99.7%，批號：190015-201302，中國食品藥品檢定研究院)。

1.2 內(nèi)標溶液的配制

精密稱取馬來酸10mg置于10mL容量瓶中，加入約7mL氘代甲醇超聲3min后放至室溫，用氘代甲醇定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為1.0g/L的馬來酸內(nèi)標溶液，密封備用。

1.3 樣品溶液的配制

精密稱取鹽酸巴馬汀對照品100mg，置于10mL容量瓶中，加入約7mL氘代甲醇超聲3min后放至室溫，用氘代甲醇定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為10g/L的對照品溶液。

取15片黃藤素片，于研缽中研磨成細粉。精密稱取約5mg(以鹽酸巴馬汀計)置于5mL容量瓶中，加入內(nèi)標溶液約4mL，超聲5min后放置至室溫，以馬來酸內(nèi)標溶液定容至刻度。過0.45μm微孔濾膜后轉(zhuǎn)移至核磁管中，即得黃藤素片供試品溶液。

1.4 測試條件

采用zg30脈沖序列，恒溫測定溫度為300K，譜寬(SWH)為8012Hz，中心頻率(O1)設(shè)為2503Hz，采集時間(AQ)為4.01s，弛豫時間(D1)為15s，樣品掃描次數(shù)(NS) 為64次，空掃次數(shù)(DS)為2次。

1.5 含量計算方法

將測得的1H NMR進行相位校正，對定量峰和內(nèi)標峰積分5次，求取平均值，按照下式計算鹽酸巴馬汀含量：Wu=WsAuEu/(AsEs)，式中：Wu為鹽酸巴馬汀的質(zhì)量(mg)；Au為鹽酸巴馬汀的定量峰面積；As為馬來酸內(nèi)標的峰面積；Ws為馬來酸內(nèi)標的質(zhì)量(mg)；Eu為鹽酸巴馬汀的質(zhì)子當量(鹽酸巴馬汀相對分子質(zhì)量與定量峰代表的質(zhì)子數(shù)之比)；Es為馬來酸的質(zhì)子當量(馬來酸相對分子質(zhì)量與內(nèi)標峰代表的質(zhì)子數(shù)之比)。

圖1 黃藤素片提取物的1H NMR(A)、13C NMR(B)與HSQC(C)圖譜Fig.1 1H NMR(A),13C NMR(B)and HSQC(C) spectra of the extract of Huangtengsu tablet

2 結(jié)果與討論

2.1 黃藤素片提取物的鑒別

取適量黃藤素片粉末加入氘代甲醇，超聲后放至室溫，測定其1H NMR、13C NMR和HSQC譜(圖1)。1H NMR譜(圖1A)顯示22個質(zhì)子[9]，包括低場區(qū)6個芳香質(zhì)子，5位和6位的2個亞甲基質(zhì)子，2、3、9、10位的4個甲氧基質(zhì)子。13C NMR譜(圖1B)顯示21個碳信號，對應(yīng)于結(jié)構(gòu)中的21個碳原子。HSQC譜(圖1C)顯示12個相關(guān)點(見表1)，9個季碳無相關(guān)點。綜上，1H NMR、13C NMR和HSQC譜的基本信息與鹽酸巴馬汀分子式(C21H22ClNO4)相符。

2.2 氘代溶劑與內(nèi)標的選擇

考察了氘代甲醇和氘代二甲基亞砜作為提取溶劑時對黃藤素片中鹽酸巴馬汀含量測定的影響。結(jié)果顯示，以氘代二甲基亞砜為提取溶劑時，1H NMR的雜質(zhì)成分較多，這可能是由于氘代二甲基亞砜溶解了片劑輔料所致[10]。另外，氘代二甲基亞砜樣品溶液在冬季室溫配制時極易凝固，需加熱溶解后才可測定，而加熱處理會導(dǎo)致溶液體積發(fā)生變化，對測定結(jié)果造成一定影響，且樣品溶液粘度較高。而以氘代甲醇作為提取溶劑時，不僅無片劑輔料雜質(zhì)成分干擾，且樣品溶液狀態(tài)不受季節(jié)影響，操作簡單方便。綜合考慮，最終選用氘代甲醇作為提取溶劑。

內(nèi)標物一般選擇易于識別且不干擾樣品定量的尖銳單峰。本實驗選擇氘代甲醇為溶劑，馬來酸為內(nèi)標物質(zhì)，混合物的1H NMR譜圖見圖2。馬來酸溶劑峰在δ6.31處呈尖銳的單峰，與鹽酸巴馬汀的1H NMR峰不重疊，專屬性較高。因此，選擇馬來酸作為內(nèi)標物。由于鹽酸巴馬汀在δ7.07處為一尖銳、獨立的單峰，附近無其他雜質(zhì)干擾，因此選擇該處信號作為定量峰。

2.3 方法學(xué)研究

前期對qNMR采集時間、弛豫時間和樣品掃描次數(shù)等基本測試參數(shù)的研究[9]表明，當采集時間大于4.01s時可保證FID信號衰減完全，得到的1H NMR譜基底無震蕩，因此確定采集時間為4.01s。當弛豫時間大于15s時，樣品定量峰與內(nèi)標峰的比值基本保持不變，為節(jié)約測試時間，確定弛豫時間為15s。同理，樣品掃描次數(shù)確定為64次。另外，定量峰與內(nèi)標峰的積分區(qū)域?qū)y試結(jié)果影響也較大，本文選取峰形輪廓線與水平基線交叉處作為積分區(qū)域，測得待測物定量峰的積分區(qū)域為δ7.01～7.13，內(nèi)標峰的積分區(qū)域為δ6.27～6.35。本實驗在此條件下進行方法學(xué)研究。

2.3.1線性關(guān)系以“1.2”的內(nèi)標溶液配制1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 g/L的鹽酸巴馬汀對照品系列溶液。以鹽酸巴馬汀與馬來酸的定量峰面積之比(As/Ar)為橫坐標(x)，鹽酸巴馬汀與馬來酸的質(zhì)量比(ms/mr)為縱坐標(y)進行線性回歸，得回歸方程為y=3.820 4x-0.092 2(r=0.999 3)，線性范圍為1.00～10.00 g/L。

2.3.2儀器精密度取供試品溶液，按“1.4”條件連續(xù)測定6次，獲取1H NMR并積分(5次積分結(jié)果取平均值)，計算鹽酸巴馬汀定量峰與內(nèi)標峰面積的比值。結(jié)果顯示，6次測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)為0.39%。

表1 黃藤素片提取物的結(jié)構(gòu)解析Table 1 Structural analysis of the extract of Huangtengsu tablet

圖2 黃藤素片提取物與馬來酸混合物的1H NMR圖譜Fig.2 1H NMR spectrum of the extract of Huangtengsu tablet and maleic acid mixture

2.3.3樣品穩(wěn)定性取同一份樣品分別于0、2、4、8、12 h進行測定，獲取1H NMR并積分(5次積分結(jié)果取平均值)，計算鹽酸巴馬汀定量峰與內(nèi)標峰面積的比值。結(jié)果顯示，5次測定結(jié)果的RSD為0.65%，因此樣品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.4重復(fù)性按照“1.3”方法平行配制6份樣品溶液，獲取1H NMR并積分(5次積分結(jié)果取平均值)，計算黃藤素片中鹽酸巴馬汀的含量。結(jié)果顯示，6份樣品測定結(jié)果的RSD為1.7%。因此，qNMR法測定結(jié)果的重復(fù)性良好。

2.3.5檢出限與定量下限取對照品溶液逐步進行稀釋，按照“1.4”測試條件分別進樣測定，以鹽酸巴馬汀的峰高與基線波動高度比值作為信噪比(S/N)，以S/N為3時的鹽酸巴馬汀質(zhì)量濃度作為檢出限(LOD)，S/N為10時的鹽酸巴馬汀質(zhì)量濃度作為定量下限(LOQ)[3-4]。得到所建立qNMR方法的LOD為8.5 mg/L，LOQ為25.0 mg/L。

2.3.6回收率試驗按照“1.3”方法配制供試品溶液，分別加入低、中、高3個質(zhì)量濃度的鹽酸巴馬汀對照品溶液，每個濃度平行配制3份，采用建立的qNMR法進行測試并計算回收率，結(jié)果見表2。3個加標水平下的回收率為98.5%～104%，RSD為1.4%～2.3%。

表2 片劑中鹽酸巴馬汀的回收率試驗結(jié)果Table 2 Recoveries of hydrochloride palmatine in tablets

表 3 不同方法對片劑中鹽酸巴馬汀含量的測定結(jié)果Table 3 Determination result of hydrochloride palmatine in tablets by different methods

2.4 與高效液相色譜法測定結(jié)果的比較

參考《中國藥典》2015年版一部的方法對黃藤素片中鹽酸巴馬汀的含量進行測定。結(jié)果顯示(表3)，高效液相色譜法與核磁共振波譜法的測定含量較為接近。黃藤素片的標示量為100 mg/片，按照《中國藥典》2015年版的要求，黃藤素片中鹽酸巴馬汀的含量應(yīng)為標示量的90.0%～110%，因此兩種測定方法的結(jié)果均符合《中國藥典》要求。

3 結(jié) 論

本研究采用qNMR法測定了黃藤素片中鹽酸巴馬汀的含量，測定無需對照品和分離過程，樣品配制過程簡單，可有效減小樣品前處理對測定結(jié)果的影響。建立的qNMR法同時實現(xiàn)了黃藤素片中鹽酸巴馬汀的定量分析與定性鑒別，且操作簡單、快速、省時省力，測定結(jié)果與高效液相色譜法基本一致。由于qNMR法集定性鑒別與定量測定于一體，在藥物質(zhì)量控制包括有效成分鑒別、雜質(zhì)檢查及有效成分含量測定等中的應(yīng)用將日益廣泛，不僅有助于制藥企業(yè)控制產(chǎn)品質(zhì)量，也為我國打擊假冒偽劣藥品提供了一種非常有力的監(jiān)測手段。