無創胚胎植入前非形態學質量評價的研究進展

劉麗英

（沈陽市婦嬰醫院生殖中心，遼寧 沈陽 110014）

近年來不孕不育的發病率顯著升高，越來越多的不孕家庭選擇通過輔助生殖技術獲得子代，但輔助生殖的成功率呈現出停滯不前的局面。目前為了提高妊娠率，大多生殖中心采取多胚胎移植的方式，使得多胎妊娠率居高不下，同時也提高了減胎術的使用及一些母嬰并發癥的發生率，而即使應用多胚胎移植的策略，妊娠率也十分有限。因此，提高用于移植的單個胚胎質量成為了關鍵，一方面可以提高胚胎自身的質量，另一方面可以改變篩選策略。而目前胚胎自身質量并不是限制妊娠率的主要因素，提升空間也十分有限，且多數患者并不缺少可供篩選的胚胎，因此改進篩選策略可能是最有希望突破目前較低臨床妊娠率的途徑。目前應用最廣泛、最基本的胚胎篩選方法是通過靜態的胚胎形態學觀察對胚胎的質量進行評級［1］。該方法操作簡便，評估效率高，但評估指標較單一，受主觀經驗影響較大，只能反映出某些特定時間點的胚胎狀態，使得評估結果與真實質量之間存在一定差異，可能導致同一級別的胚胎有著完全不同的發育潛能［2］。據報道，胚胎染色體非整倍性是移植失敗的重要原因，而近年來，隨著二代測序等技術的發展，大大提高了胚胎染色體檢測的效率，在臨床上得到了推廣，該技術能夠有效檢出遺傳物質有缺陷的胚胎，為胚胎篩選增加了可靠的依據［3-5］。但該技術需要通過胚胎活檢來獲取細胞進行檢測，該過程對胚胎的影響存在爭議，Gleicher等［6］對大量研究總結后甚至認為目前臨床使用胚胎植入前遺傳學篩查（preimplantation genetic screening，PGS）技術應該被限制在研究階段。因此，尋求可替代途徑以及新的篩選條件成為了近年來的研究熱點，主要分為兩個方向，一是與胚胎緊密接觸的環境，另一方向是改進傳統篩選技術。近年來在對胚胎液體環境的研究中取得了大量的研究成果，發現了多種可能與胚胎質量相關的物質，包括DNA、mtDNA、蛋白質、氨基酸等。另外，延時成像技術的應用補充了傳統形態學的不足，能夠提供胚胎發育過程的動態過程數據，極大地豐富了胚胎篩選的客觀依據。而且更多的評價方法有望應用于胚胎植入前的評估，從不同的角度更加準確地預測胚胎的發育潛能，最終提高胚胎移植成功率以及實現單胎移植等需求。

1 囊胚液

囊胚液存在于胚胎囊胚腔中，與胚胎關系密切，受培養環境影響較小。囊胚液可以通過囊胚穿刺的方法吸取獲得，雖然該方法需要通過對囊胚的滋養層做微穿孔來吸取囊胚液，但這種操作與玻璃化冷凍的穿刺引流過程相同，不會造成不良影響［7］，因此囊胚液的獲取基本上符合無創操作的目的。目前對于囊胚液的研究相對較少，主要原因是取材時間窗較短、有一定操作難度、所得液體量微小等，單個胚胎通常僅能獲取出約0．01 ml左右的囊胚液，十分有限［8］。

囊胚液中存在核DNA，并且可以成功地純化、擴增以及進行遺傳學分析［8-11］。Palini等［9］對位于17號染色體上的TBC1D3以及位于Y染色體上的TSPY1這兩種多拷貝基因進行初步分析，在90%的囊胚液樣本中成功擴增了TBC1D3。在成功擴增TBC1D3的樣本中，65%的樣本檢出了TSPY1，表明這些胚胎攜帶有Y染色體［9］。該研究說明，囊胚液中存在核基因，且可能用于性別鑒定。但是，由于目前檢測敏感性較低，單拷貝基因的檢測受到了一定限制［12］。

確認囊胚液中的DNA是否具備胚胎基因組代表性十分重要。Gianaroli等［10］將囊胚液與同胚胎來源的極體、卵裂球或滋養層細胞活檢中分離出的核DNA相對比，在成功進行全基因組擴增（77%）的囊胚液樣本中，有95%的染色體整倍性與極體或卵裂球活檢一致，97%與滋養層細胞一致。隨后，同一研究組還進行了更大樣本量的驗證，結論支持了囊胚液核DNA的胚胎代表性［8］。另有研究得出了不同的結論，該研究對每個胚胎進行卵裂球、囊胚液及滋養層細胞的染色體整倍性分析，結果成功擴增的囊胚液樣本（63%）中得出86%的非整倍性，其中62%與滋養層細胞相符［11］。值得注意的是，基于較低的敏感性，非整倍性樣本有可能為擴增偏倚所致。另外Tobler等［11］還發現，70%的非整倍性卵裂期胚胎最終轉歸為整倍性囊胚。該結果可能揭示了胚胎發育的一種機制，即在囊胚形成過程中，非整倍體細胞可能會被選擇性排除到胚胎細胞外，進入到囊胚液中。

另有學者對囊胚液DNA的可能來源進行了分析，除胚胎主動釋放的可能性外，主要存在兩種觀點，一種可能的來源是胚胎細胞受損：囊胚穿刺取樣時會在胚胎上形成微小的穿孔，但其破壞性極微，且囊胚穿刺本身不太可能引起胚胎細胞的裂解，但取樣之前已損傷或部分溶解的細胞所釋放的物質可能會被吸出并分離出來［11，13-14］；另一種可能是來源于污染物質，例如極體、顆粒細胞或精子等。極體帶來污染的可能性較小，僅在卵母細胞的擠壓下可能釋放出極少的遺傳物質［15］。為了避免精子污染，大多數研究選擇卵泡漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）受精胚胎來避免影響［16-18］。而顆粒細胞可以在ICSI之前，用透明質酸酶去除，為避免長期暴露于透明質酸酶損害卵母細胞的發育潛能，一些緊密黏附在透明帶上的顆粒細胞可以在培養到第3天再次進行剝離。

囊胚液DNA的研究取得了大量成果的同時還存在諸多需要解決的問題，不同研究中囊胚液DNA的擴增水平差異較大［8-11］，還可能存在部分甚至全部基因無法擴增或達不到可檢測水平，使得結果分析易受假陽性的影響［19］。而對于已成功進行DNA擴增的樣本，其得到的擴增產物在數量和質量上與胚胎活檢相比仍有差距［8，10-11］。另外，與單細胞擴增同樣面臨著不均等擴增和等位基因脫扣等問題。

受到囊胚液本身含量等因素的限制，目前的研究主要圍繞核DNA展開，而缺乏對于mtDNA、RNA、蛋白質等物質的探索。有報道稱，囊胚液中存在由胚胎分泌的miRNAs，提示供體細胞可能以囊胚液為媒介對受體細胞施加基因調控作用［20］，這可能代表了胚胎存在細胞間通訊機制來調控胚胎的發育過程。

2 胚胎培養基

胚胎培養基是胚胎在體外培養過程中賴以生存的液體環境，能夠為胚胎提供各種生長發育所需的必要物質。與囊胚液相比，對胚胎培養基的研究更加豐富和具體，主要是因為取材時間靈活，方法簡單，獲取樣本量相對較大等優點，但同樣存在來源、機制以及擴增水平等問題，缺點是更易受到污染。胚胎培養基各成分明確，同時還能夠接收來自胚胎釋放和代謝的產物，與胚胎有著密切的關系，因此在胚胎發育的關鍵節點選擇性地對目標物質進行檢測能夠反映胚胎的代謝能力以及發育潛能等信息，有助于胚胎的篩選。近些年來主要在核酸及蛋白質等方面進行了大量的研究。

2．1 核酸 有研究表明，在胚胎培養基中能夠檢測到核 DNA 和 mtDNA［16-18，21］。Stigliani等［16］利用微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridization，aCGH）技術證明胚胎培養基中存在Y染色體。Wu等［18］認為胚胎培養基可用于檢測某些單基因疾病，對α-地中海貧血分析的結果顯示，胚胎培養基診斷效率（89%），介于卵裂球活檢（82．1%）以及囊胚活檢（100%）的診斷效率之間。最近的一項研究對突變的IVS-II-654位點和SNP連鎖的分析證實，培養基中存在的DNA起源于胚胎細胞［22］。Stigliani等［16］利用卵裂階段胚胎培養基對mtDNA進行分析，結果mtDNA的檢出率為99%，高于同樣本群的核DNA檢出率（63%），且mtDNA的含量也更高，這可能與胚胎分裂程度的增加以及分裂期細胞質的損失有關。另外還發現，這種現象對于35歲以上的患者尤其明顯，表明女性年齡與胚胎培養基中mtDNA的水平可能存在相關性［16］。同一組的一項后續研究發現第3天培養基中較高的mtDNA/核DNA代表了具有少量碎片的高質量以及高著床率的胚胎［17］。

RNA的研究相對較少，Capalbo等［23］在胚胎培養基中找到兩種起源于滋養外胚層的miRNAs，認為是篩選整倍體胚胎植入的潛在候選生物標志物。此外，Kropp等［24］研究發現miR-24能夠抑制胚胎的發育，而在發生退化的胚胎培養基中可以檢測到較高的表達水平，說明miR-24可能被用于評估胚胎的質量。

目前對于胚胎培養基中的遺傳物質檢測還存在一定的問題和缺陷，不僅需要進行嚴謹的研究來充分闡明DNA的確切來源及主要機制，還需要解決潛在的污染問題，包括在培養期間環境中的污染，以及由顆粒細胞或精子等引起的污染。例如Assou等［21］的研究以是否擴增出TSPY1基因來界定胚胎性別，但有可能因為樣本DNA含量不足而導致擴增失敗，進而出現錯誤的性別判斷；Wu等［18］在單基因病檢測中添加了空白培養基作為對照，但仍未能充分排除顆粒細胞等污染來源的可能。此外，對相同的胚胎群同時進行胚胎培養基和囊胚液的相關檢測可能會有所發現，因為它們之間很可能存在某些關聯和相似的機制。

2．2 蛋白質 胚胎質量還可以利用培養基中的蛋白質來評價，了解胚胎對蛋白質的利用及釋放的情況，從不同的角度獲取胚胎發育的相關信息。胚胎培養基中含有多種蛋白質成分，包括可溶性人類白細胞抗原G（sHLA-G）、胰島素樣生長因子（IGFs）及血小板活性因子（PAF）等。sHLA-G是非經典的HLA-Ⅰ類抗原，在母胎免疫耐受中起著重要作用。Verloes等［25］通過免疫熒光技術檢測發現胚胎期各個階段均有sHLA-G的表達。Rembmann等［26］對多中心的胚胎培養基進行大樣本隨機檢測表明，sHLA-G的表達與卵裂期胚胎具有明顯的相關性。Sher等［27］發現培養基中sHLA-G與移植后的妊娠率呈正相關，而最近的一項Meta分析也證實：具有sHLA-G的胚胎培養基與臨床妊娠率顯著相關［28］，這表明sHLA-G可能成為評價胚胎發育質量的一個重要潛在指標。IGFs是一種具有多種生物學活性的蛋白多肽物質，在植入前胚胎的各個時期均有表達［29］，有促進胚胎發育的作用［30］。Pantaleon 等［31］認為IGF可能促進胚胎對葡萄糖的攝取進而提高胚胎發育質量及著床能力，因而胚胎分泌到培養液中的IGF水平具有一定的參考價值。PAF屬于磷脂類物質，具有廣泛的生物活性［32］。PAF可以調節胚胎的發育能力，促進細胞分裂和囊胚的形成，而分泌高水平PAF的胚胎更易于妊娠［33-34］，其機制可能是調節胚胎對葡萄糖和乳糖的代謝來影響發育［35］。另外，脂質運載蛋白-1、載脂蛋白A1和白血病抑制因子都被認為與胚胎的發育質量有關。脂質運載蛋白-1在非整倍性囊胚中分泌量增大［36］，載脂蛋白A1在形態學分級較高的胚胎培養基中含量也更高［37］。

2．3 其他具有潛在應用價值的物質 氨基酸作為蛋白質的基本構成單位在胚胎發育的過程中也起著重要作用。Houghton等［38］首次利用液相色譜-質譜聯用技術對發育潛能較好的胚胎進行氨基酸測定，發現在這些胚胎中氨基酸均處于較低的代謝水平。Nadal-Desbarats等［39］應用質子磁共振技術檢測胚胎培養基也證實了上述結論。另外，還有學者發現氨基酸的含量與妊娠率有一定的相關性［40］，不同性別的胚胎對氨基酸的利用率也有差異［41］。雖然對于氨基酸的研究較多，但對哪些與胚胎狀態之間具有相關性仍缺乏統一的認識，因此何種氨基酸適用于胚胎篩選仍需要更多高水平的研究來確立。

除核酸與蛋白質類物質外，胚胎培養基中還有一些其他種類物質可以用于胚胎質量評價，如在胚胎培養基中HCG的含量與妊娠率呈正相關［42］，CD146 與移植成功率呈負相關［43］。另外，碳水化合物為胚胎提供了能量來源，早期主要由丙酮酸和乳酸提供，而在隨后的發育過程，逐漸轉變為葡萄糖提供，不同階段的能量代謝特征能反映胚胎的發育潛能［44］。

3 胚胎形態的延時成像

目前常規培養系統主要以伊斯坦布爾共識［1］為依據，在特定的時間點根據胚胎靜態的形態學描述進行評級。但胚胎發育是一個連續的過程，選取特定的幾個關鍵時間點觀察雖然能描述胚胎發育的大致輪廓，但無法給出具體的原核消失的時間、卵裂時間、卵裂模式等數據，而這些數據對評估胚胎發育潛能具有重要的指導意義［45-46］。在操作上，傳統形態學觀察需要反復開箱來觀察胚胎的狀態，觀察節點越多對評價越有利；而每次觀察都會給胚胎帶來溫度、濕度及氣體等環境條件的改變，對胚胎的微環境產生影響，這反過來又要求盡量降低觀察頻率，這種矛盾使得傳統形態學難以突破自身局限性。同時，形態的評估會受到主觀因素的影響，因為胚胎在單一時間點上所展現的形態可能不夠典型［47］，導致大多情況下只能繼續培養監測；然而，胚胎體外培養時間有限，未必有充足的時間用來觀察。延時成像技術將高分辨率瞬時曝光攝像元件與胚胎培養裝置整合，每間隔一定的時間自動對胚胎進行拍攝并合成動態畫面，并通過與攝像器材相連的計算機來記錄胚胎的發育情況以及相應的時間節點資料［48］。這樣不僅維持了觀察過程中胚胎所處環境的穩定［49］，而且還能夠自動保存復雜的數據和胚胎圖像，用以分析卵裂模式、卵裂時間、卵裂同步性等傳統形態學無法記錄的信息，大大擴增了觀察資料和分析的靈活性［50-51］。

卵裂模式主要從卵裂均等性、卵裂倍增性（單細胞分裂后生成的細胞數量，正常單個細胞分裂后生成兩個子代細胞）、卵裂球融合、卵裂停滯等方面對胚胎發育進行評價。有研究證明，卵裂倍增異常的胚胎囊胚形成率（11．7%）和種植率（3．7%）較低［52］，而流產率較高［53］，可能是異常的卵裂模式造成非整倍性及多核率顯著增高［54］，甚至胚胎染色體異常，進而導致妊娠率降低及流產率升高的發生［55］。卵裂停滯為胚胎出現1個或以上卵裂球的長時間停止分裂的現象，可能是由于調控胚胎發育的過程中出現了障礙，此類胚胎多為非整倍體或嵌合體胚胎［56］。而卵裂球融合的出現也不利于胚胎的發育，此類胚胎囊胚形成率極低，發育潛能低下［57］。在對胚胎多核性進行分析中發現，帶有非正常核數的卵裂球多為非整倍體，胚胎移植潛能低，而該現象只有在卵裂特定時期才能觀察到，常規的觀察方法會漏掉70%以上，因此延時成像技術能夠有效避免多核卵裂球胚胎的移植［58］。卵裂時間主要研究卵裂期細胞數與對應培養時間的關系以及處于某一細胞數所持續的時間，進而對兩個形態學評級相同的胚胎可能觀察到完全不同的發育過程。Wong等［59］研究結果表明，受精卵發育至2細胞所需時間可預測胚胎的質量和種植力。Meseguer等［60-61］進一步研究認為卵裂球維持2細胞狀態的時間≤11．9 h表明胚胎著床能力較高。在受精后（68±1）h正常的胚胎細胞數應為8個［45］，而其他細胞數的胚胎可能存在分裂異常、細胞融合、碎片化等問題，可能最終影響胚胎整體的發育潛能［62］。此外，還有研究表明原核消失時間較早的胚胎發育潛能較好［63］。

延時成像很好地彌補了傳統形態學評級的不足，在傳統形態學數據的基礎上提供大量的相關資料，同時還避免了反復開箱等對胚胎有影響的操作，為提高植入前胚胎的質量提供了可行的方案。因此與胚胎液體環境的檢測相比，該技術更具有現實的可行性，更容易被臨床接受。但有報道顯示，頻繁的曝光會對胚胎的發育造成一定的不良影響［64］，原因可能是誘發細胞膜上的不飽和脂肪酸與類脂產生氧化反應，從而導致細胞內活性氧簇（ROS）生成增多所致［65］。大量的ROS可導致細胞內DNA及其他重要結構被破壞，從而對胚胎發育產生負面影響，因此，一般選用細胞敏感度較低的光源以及合理的曝光頻率來減低光源性的影響。

4 總結與展望

雖然胚胎的構成比較簡單，但其發育潛能巨大，單一的形態學指標不足以預計胚胎的最終結局，而在多水平、多維度進行綜合評價也許是更有效的手段。無創的方法可以避免活檢對胚胎造成的無法預知的影響，但并非一定要取代有創操作，其最主要的目的是增加評估方法的多樣性和選擇性，從多角度預測胚胎的發育情況，為胚胎篩選提供更準確依據。然而，并非篩選條件越多效果就會越好，復雜的篩選條件不僅面臨著更多的操作風險，還會導致更多的胚胎被剔除，這使得獲取胚胎數量較少的患者可能無優質胚胎移植，因此，合理利用篩選方法并確保高水平的準確性和敏感性十分重要。另外，還應不斷提高胚胎培養的整體質量水平，為篩選提供更有利的條件。