CCL3對大鼠糖尿病神經病理性疼痛的影響*

彭志鋒，劉穎，李晨旭

（山西大同大學醫學院 生理教研室，山西 大同 037009）

糖尿病神經病理性疼痛是糖尿病常見并發癥[1]。許多證據表明，脊髓背角（spinal dorsal horn, SDH）小膠質細胞激活在病理性疼痛中發揮重要作用[2-3]。以往研究表明，在脊髓神經損傷模型中小膠質細胞合成和釋放趨化因子配體3（CC-chemokine ligand 3,CCL3）有助于誘導機械異常性疼痛[4]。大鼠鞘內注射CCL3可產生機械痛覺過敏[5]。CCL3也可激活其同源受體CCR5和CCR1，鞘內注射CCR5拮抗劑可減輕外周神經損傷引起的疼痛過敏[5]。此外，嘌呤P2X7受體（purinoceptor P2X7 receptors, P2X7R）的表達也可促進SDH小膠質細胞釋放CCL3[6]。然而，脊髓CCL3和P2X7R在糖尿病神經病理性疼痛模型中的作用未見相關報道。因此，本研究目的是探討脊髓CCL3和P2X7R在鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ）誘導大鼠糖尿病神經病理性疼痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 雄性SD大鼠，體重180～200 g，購于山西醫科大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（晉）2009～0001。室內溫度保持在25℃左右，濕度約為50%。12 h晝/夜循環照明，自由飲水和進食。將SD大鼠隨機分成對照組和STZ組，每組25只。根據鞘內注射藥物將STZ組進一步分為CCL3組、IgG2A，以及A438079組、PBS組，每組5只。實驗前各組大鼠體重、空腹血糖和縮足閾值（paw withdrawal threshold, PWT）比較，差異無統計學意義，具有可比性。

1.1.2 實驗儀器和試劑 冷凍切片機（德國Leica公司，SM2010），STZ、A438079（P2X7R拮抗劑）、抗兔Alexa Fluor 488購自美國Sigma公司，Iba1抗體（美國Millipore公司），CCL3中和抗體、IgG2A購自南京多瑞斯科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠糖尿病模型的復制 用生理鹽水配置成2% STZ，大鼠腹腔單次注射65 mg/kg STZ[7]。檢測STZ腹腔注射1周后大鼠尾靜脈空腹葡萄糖水平及1個月后體重變化，對糖尿病發病進行評估。糖尿病大鼠只有空腹血糖濃度＞240 mg/dl才可用于研究。測空腹血糖前大鼠禁食12 h，不禁水。對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠鞘內插管 采用1%戊巴比妥鈉（0.06 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，頸后部剪毛、消毒，在兩耳連線中央做縱向切口，暴露枕骨寰枕膜，插入10號PE管約6～7 cm至蛛網膜下池后固定。術后腹腔注射青霉素鈉（8×105u/d），預防感染。STZ注射前1 d通過鞘內注射CCL3中和抗體（4 ng/10μl，10μl）或對照 IgG2A，以及 A438079（1μg/10μl，10μl）或對照PBS，1次/d，持續 7 d。

1.2.3 免疫熒光 采用10%水合氯醛（150～200 mg/kg）麻醉大鼠，PBS心臟灌注，將大鼠腰段脊髓L5部分取出，在4%多聚甲醛中過夜固定，在4℃冰箱內通過20%和30%蔗糖溶液脫水，直至標本沉底。用OCT包埋脫水的標本，冷凍切片機切片厚約20μm。用 30 ml甲 醛、10 ml PBS、500μl 30% H2O2封 閉10 min，去除組織中內源性過氧化物酶。兔源多克隆Iba1抗體（1∶1 000）室溫下孵育24 h，PBS洗凈后加入熒光標記二抗Alexa Fluor 488，室溫孵育1 h。采用熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司，SZ61GFP-D）計數SDH中Iba1陽性細胞數。

1.2.4 行為學觀察 模型復制前，以及復制后1、3、5、7、14和21 d對大鼠進行PWT測定。在行為學測試前，所有動物適應實驗室≥2 h。采用1.0～15.0 g von Frey細絲垂直刺激大鼠后足中央處，持續5～10 s，出現明顯縮足、舔足及抬足行為為陽性反應，結果重復3次，每次間隔5 min。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR） 通 過RNA提取試劑盒提取大鼠腰段脊髓L5背角總RNA，進行逆轉錄反應（RNA樣品14μl，反應緩沖液4μl，酶混合物2μl），使用基因特異性引物進行qRT-PCR擴增（稀釋cDNA模板8μl，PCR引物2μl，SYBR?綠化染料10μl），引物序列見表1。通過分析軟件計算目的基因Ct，以GAPDH為內參；按照文獻[8]計算相對基因表達量 =2-（ΔCt樣品-ΔCt對照）。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糖尿病模型復制成功

2.1.1 血糖 對照組大鼠血糖（80±10.5）mg/dl，STZ腹腔注射1周后，血糖水平增加至（250.0±30.8）mg/dl，經t檢驗，差異有統計學意義（t=8.361，P=0.006）。

2.1.2 體重 飼養1個月后，對照組大鼠體重（300±40.5）g，STZ組（260.0±35.2）g，經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.834，P=0.032），STZ組大鼠體重減輕。

2.2 STZ誘導大鼠SDH小膠質細胞激活

生理鹽水和STZ腹腔注射后7、14和21 d比較大鼠PWT，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的PWT有差別（F=17.058，P=0.003）；②對照組與STZ組的PWT有差別（F=30.735，P=0.000），對照組較STZ組的PWT高。③兩組PWT變化趨勢有差別（F=14.637，P=0.002）。見表2和圖1。

表2 兩組大鼠各時間點PWT比較 （n =25，g，±s）

表2 兩組大鼠各時間點PWT比較 （n =25，g，±s）

組別 0 d 7 d 1 4 d 2 1 d對照組 1 5.0±0.0 1 0.5±1.2 1 3.8±0.7 1 3.0±1.1 S T Z 組 1 5.0±0.0 3.0±0.4 3.9±0.3 7.0±1.4

圖1 兩組大鼠PWT的變化趨勢 （n =25，±s）

對照組大鼠SDH中Iba1陽性小膠質細胞數（200.0±10.5）個；STZ處理后1、7和14 d的Iba1陽性小膠質細胞數分別為（194.0±3.0）、（400.0±23.0）和（300.0±16.8）個，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=16.428，P=0.002）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，與對照組相比，STZ處理后7和14 d的Iba1陽性小膠質細胞數增加（P＜0.05）。見圖2、3。

圖2 STZ處理后大鼠SDH中的小膠質細胞 （免疫熒光）

圖3 各組大鼠Iba1陽性小膠質細胞數比較（n =25，±s）

2.3 CCR1、CCL3和CCR5 mRNA表達的變化

2.3.1 CCR1 mRNA 對照組大鼠SDH中CCR1 mRNA相對表達量為（1.0±0.3）；STZ處理1、3、7和14 d后大鼠CCR1 mRNA相對表達量分別為（1.2±0.5）、（1.4±0.3）、（0.9±0.5）和（1.6±0.1），經單因素方差分析，差異無統計學意義（F=3.538，P=0.087）。見圖4。

2.3.2 CCL3 mRNA 對照組大鼠SDH中CCL3 mRNA相對表達量為（1.0±0.5）；STZ處理 0、3、7和14天后大鼠CCL3 mRNA相對表達量分別為（1.1±1.3）、（4.0±1.6）、（16.0±1.4）和（9.0±0.9），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=19.846，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，與對照組相比，STZ處理7和14天后大鼠CCL3 mRNA表達水平升高（P＜0.05）。見圖 5。

圖4 各組大鼠CCR1 mRNA表達水平比較（n =25，±s）

圖5 各組大鼠CCL3 mRNA表達水平比較（n =25，±s）

2.3.3 CCR5 mRNA 對照組大鼠SDH中CCR5 mRNA相對表達量為（1.0±0.2）；STZ處理 1、3、7和14 d后大鼠CCR5 mRNA相對表達量分別為（1.1±0.4）、（1.3±0.2）、（2.5±0.1） 和（2.0±0.2），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=12.052，P=0.008）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，與對照組相比，STZ處理7和14 d后大鼠CCR5 mRNA表達水平升高（P＜0.05）。見圖 6。

2.4 CCL3抗體對STZ處理大鼠PWT的影響

CCL3與IgG2A鞘內注射后第0、1、3、5和7天大鼠PWT比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的PWT有差別（F=18.735，P=0.001）；②兩組大鼠 PWT有差別（F=35.836，P=0.000），CCL3組較IgG2A組的PWT高；③兩組PWT變化趨勢有差別（F=16.952，P=0.001）。見表3和圖7。

圖6 各組大鼠CCR5 mRNA表達水平比較（n =25，±s）

表3 IgG2A組和CCL3組大鼠不同時間點的PWT比較（n =5，g，±s）

表3 IgG2A組和CCL3組大鼠不同時間點的PWT比較（n =5，g，±s）

I gG2A組 15.0±0.0 12.2±1.4 6.0±1.3 2.6±0.1 10.3±1.5

圖7 IgG2A組和CCL3組大鼠PWT的變化趨勢（n =25，±s）

2.5 P2X7R在STZ誘導機械性痛覺過敏中的作用

qRT-PCR結果顯示，STZ處理7 d后大鼠SDH中P2X7R mRNA相對表達量為（2.2±0.5），而對照組為（1.0±0.1），經t檢驗，差異有統計學意義（t=9.752，P=0.005），STZ組大鼠P2X7R mRNA表達水平升高。見圖8。

A438079與PBS處理0、1、3、5和7 d后測量大鼠PWT比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點間PWT有差別（F=20.560，P=0.001）；② 兩 組 大 鼠 PWT有 差 別（F=40.821，P=0.000），A438079組較對照組PWT值高；③兩組大鼠PWT變化趨勢有差別（F=14.752，P=0.001）。見表4和圖9。

圖8 各組大鼠P2X7R mRNA表達水平比較（n =25，±s）

表4 PBS組和A438079組大鼠不同時間點的PWT比較（n =5，g，±s）

表4 PBS組和A438079組大鼠不同時間點的PWT比較（n =5，g，±s）

P BS 組 14.0±0.0 12.1±0.0 7.3±0.3 5.4±0.5 2.5±0.0

圖9 PBS組和A438079組大鼠PWT的變化趨勢（n =5，g，±s）

3 討論

本研究結果顯示，鞘內重復給予CCL3中和抗體可抑制STZ誘導的痛覺過敏，提示CCL3在STZ處理引起的大鼠機械性痛覺過敏中起關鍵作用。盡管STZ處理大鼠SDH中CCL3表達上調的細胞類型仍不明確，但是本研究證實，SDH中CCL3表達上調與小膠質細胞增加有關系。此外，免疫熒光結果也顯示，STZ處理后大鼠SDH小膠質細胞形態肥大及數量增加，均是小膠質細胞激活的特征。以往研究發現，小膠質細胞可合成和釋放CCL3[6]。最近一項體外培養大鼠腦切片研究結果表明，腦切片神經元損傷后可誘導小膠質細胞產生CCL3[9]。也有研究證實，大鼠創傷性神經損傷后脊髓小膠質細胞中CCL3表達上調[4]。上述結果均提示，CCL3可能來源于激活的小膠質細胞。P2X7受體是一種2次跨膜蛋白，包含595個氨基酸殘基。P2X7R活化后可促進IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α和一氧化氮等的釋放，在炎癥、疼痛和神經系統疾病中發揮作用[10]。此外，P2X7R活化后也可促進小膠質細胞釋放CCL3[6]。本研究結果表明，A438079阻斷脊髓P2X7R可抑制STZ誘導的機械性痛覺過敏，其效果與CCL3中和抗體類似。大鼠外傷性神經損傷后，SDH小膠質細胞中P2X7受體表達上調[11]。因此，小膠質細胞可能是STZ處理大鼠SDH中CCL3的來源。然而，本實驗不能排除其他膠質細胞也可能釋放CCL3，因為除了小膠質細胞，星形膠質細胞也可表達CCL3[12]。最近研究提示，脊髓星形膠質細胞在化療所致機械性痛覺過敏發揮作用[13]。

本研究結果顯示，鞘內注射CCL3中和抗體或選擇性P2X7R拮抗劑——A438079均可抑制STZ處理引起的機械痛覺過敏。雖然CCL3介導STZ誘導機械性痛覺過敏機制不明確，但是CCL3可能影響脊髓疼痛信號的傳遞。研究證實，鞘內注射CCL3后，動物可產生機械刺激痛覺過敏的反應[14]。SDH中CCR5表達明顯上調，與之相匹配的是CCL3表達。CCR5在神經病理痛模型痛覺過敏中發揮作用[10]。神經損傷后脊髓激活的小膠質細胞中也表達CCR5[15]。另一方面，STZ處理大鼠SDH中CCR1表達缺乏變化。雖然以往研究報道，外傷性神經損傷后脊髓CCR1表達上調[16]，但是其差異可能是由于大鼠疼痛模型及檢測時間不同。

總之，CCL3和P2X7R在STZ誘導的大鼠機械性痛覺過敏中起重要作用。本研究結果不僅為STZ誘導周圍神經病變提供新的機制，而且為神經病理性疼痛治療提供新的靶點。