補腎化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織TGFβ1/Smad3表達的影響*

葉 蕾 余亞平 陳芝蕓 嚴茂祥 何蓓暉 蔡丹莉

浙江中醫藥大學附屬第一醫院 浙江 杭州 310006

肝纖維化是肝臟慢性炎癥反復的結果，其特點是細胞外基質(ECM)合成與降解失衡導致其在肝臟內過度沉積[1]。在細胞和分子水平，這一過程主要表現為肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）活化和轉化生長因子-β（Transforming growth factor-beta，TGF-β)及其下游信號分子異常激活；Smads蛋白為TGF-β信號最重要胞內效應因子，介導其核內外的信號轉導，并調節TGF-β家族的正、負反饋[2]。補腎化瘀方是筆者臨床治療肝纖維化的經驗方，以往研究[3]表明，該方能抗肝纖維化、改善肝組織炎癥和肝功能的作用,本研究探討補腎化瘀方對CCl4誘導肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1及其Ⅰ受體、Smad3表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：SD大鼠30只，雄性，SPF級，體重140±10g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（滬）2013-0016]。

1.2 補腎化瘀方制備：由仙靈脾、黨參、積雪草各15g，黃精20g，女貞子、郁金各12g，虎杖24g，丹參30g等組成，浙江省中醫院制劑中心制成4.4g/ml的流浸膏。

1.3 主要試劑及儀器：CCl4由上海凌峰化學試劑有限公司提供；TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScript? RT Master Mix(Perfect Real Time)及SYBR? Premix Ex Taq? II(TliRNaseH Plus)由寶生物工程（大連）有限公司提供。α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、TGF-β1兔單抗為美國Abcam公司產品，Smad3鼠單抗為美國Santa Cruz公司產，超敏酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。AB17900PCR擴增儀為美國ABI公司產品，Nikon eclipse 80i光學顯微鏡為日本Nikon公司產品。

1.4 實驗方法：30只大鼠適應性喂養1周后隨機分為正常組、模型組、補腎化瘀方組共3組，每組10只。模型組和補腎化瘀方組以橄欖油稀釋的40%CCl4皮下注射，0.3ml/100g，首劑加倍，2次/周，共6周；正常組以等容量橄欖油皮下注射代替；同時補腎化瘀方組每天灌服4.4g/ml的補腎化瘀流浸膏1ml/100g，正常組和模型組則每天以等容量的生理鹽水灌胃，均連續6周。于末給藥次當晚禁食不禁水16h，次日空腹麻醉下處死，收集肝臟標本，部分存于-80℃用于熒光定量PCR檢測，部分肝右葉組織10%中性甲醛中固定，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，用于免疫組化檢測。肝組織α-SMA、TGF-β1及其Ⅰ型受體[TGF-β receptorⅠ（TβRI）]、Smad3等基因mRNA表達采用實時熒光定量PCR檢測，以β-actin為內參，相對表達量（2-△△Ct）表示目標基因表達量，引物由生工生物工程（上海）有限公司設計并合成。引物基因序列見表1。

表1 引物基因序列

肝組織α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白表達采用免疫組化檢測。結果判斷：α-SMA陽性細胞表現為胞漿呈棕黃色，少部分膜表達；TGF-β1陽性細胞為胞漿呈棕黃色；Smad3陽性細胞表現為胞漿/核呈棕黃色；以陽性細胞著色程度和范圍進行半定量[4]。

1.5 統計學方法：采用SPSS21.0軟件進行數據統計分析，計量資料以±s表示。行正態性檢驗，非正態分布資料轉換成正態分布，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 補腎化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織α-SMA、TGF-β1、TβRⅠ和Smad3基因mRNA表達的影響：模型組大鼠肝組織α-SMA、TGF-β1、TβRⅠ及Smad3三者mRNA表達較正常組顯著上調（P＜0.01），應用補腎化瘀方干預后，肝組織上述基因mRNA表達較模型組明顯下調（P＜0.05,P＜0.01），見圖1。

圖1 肝組織α-SMA、TGF-β1、TβRⅠ及Smad3mRNA的表達（±s,n=10）

2.2 補腎化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織α-SMA、TGF-β1、TβRⅠ、Smad3蛋白表達的影響：模型組大鼠肝組織α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白表達水平較正常組明顯增強（P＜0.01），補腎化瘀方組組大鼠肝組織α-SMA、TGF-β、Smad3的表達較模型組不同程度下降（P＜0.05,P＜0.01），見表2。

表2 補腎化瘀方對肝組織α-SMA、TGFβ1、Smad3蛋白表達的影響（±s,n=10）

表2 補腎化瘀方對肝組織α-SMA、TGFβ1、Smad3蛋白表達的影響（±s,n=10）

Smad3 0.80±0.75 3.85±0.97**2.35±0.71**#分組正常組模型組補腎化瘀方組α-SMA 1.40±0.52 4.65±1.38**3.00±0.82**#TGF-β1 1.10±0.74 5.10±1.20**2.70±0.92**##

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

3 討論

ECM主要來源于HSC，HSC激活并轉化為肌成纖維細胞是肝纖維化形成的核心。TGF-β1作為最重要的促HSC活化的細胞因子，由肝巨噬細胞、肝竇內皮細胞等合成分泌，激活HSC，同時能促進HSC自分泌、旁分泌TGF-β1，產生自我增殖的循環過程，活化臨近HSC大量合成膠原[5]。細胞外TGF-β1與細胞表面TβR相互結合，能夠激活其下游的信號轉導分子smad2/3/4蛋白，形成復合物，最終轉移入細胞核，直接或參與調節因子形成轉錄復合子，以誘導目的基因的轉錄表達[6]；因此有研究認為，抑制TGF-β1的表達和TGF-β/smad信號通路的激活，是阻斷肝纖維化的關鍵[7]。

補腎化瘀方由仙靈脾、黃精、女貞子、黨參、虎杖、郁金、丹參、積雪草等組成，具有補腎益氣，化瘀解毒等功效[3]。本研究發現，肝纖維化模型大鼠HSC活化標志物α-SMA mRNA和蛋白表達均較正常組明顯上調，TGF-β、TβRⅠ、Smad3的表達也較正常組顯著增強；而補腎化瘀方干預后能抑制上述關鍵分子mRNA和蛋白的過表達，提示模型大鼠肝組織HSC活化，TGF-β1/Smad3信號通路激活，補腎化瘀方能降低肝組織中TGF-β1、TβRⅠ及其信號轉導分子Smad3的mRNA及蛋白表達水平，從而抑制HSC活化增殖、抑制TGF-β1通過信號轉導分子Smad3促肝纖維化的作用。