蛋白激酶C活化對兔視網膜色素上皮細胞抗氧化能力的影響及機制研究

衛冬 陳麗娟 教瑩瑩 李紅玉 孫兆義

[摘要]目的 通過激活兔視網膜色素上皮細胞（RPE）內蛋白激酶C（PKC），觀察RPE細胞核內轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）的表達情況以及細胞內谷胱甘肽（GSH）的表達水平。方法 應用免疫熒光染色鑒定原代培養兔視網膜色素上皮細胞（RPE），將第3代RPE細胞分為空白對照組（15%胎牛血清的DMEM培養液，n=8）、PMA組（15%胎牛血清的DMEM培養液+4 μl 100 nmol/L PKC特異激活劑佛波酯溶液，n=8）和PMA+BST組（用4 μl 10 μmol/L Nrf2抑制劑鴉膽苦醇溶液預處理RPE細胞1 h后，吸出并加入含PMA 4 μl 100 nmol/L的15%胎牛血清的DMEM培養液，n=8），培養24 h后，采用Western-blot方法檢測Nrf2蛋白在胞質和胞核內的表達，采用GSH試劑盒檢測各組RPE細胞內GSH的表達，對細胞核內Nrf2及細胞內GSH表達進行相關性分析，采用免疫熒光染色檢測Nrf2蛋白在細胞內轉位情況。結果 RPE細胞胞質內可見黑色素顆粒，呈長梭形，鼠抗人角蛋白（AE1/AE3）免疫熒光染色鑒定呈強陽性；Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，PMA組和PMA+BST組胞質內Nrf2蛋白表達顯著減少，胞核內Nrf2蛋白表達顯著增加，其中PMA組胞質內Nrf2蛋白表達較PMA+BST組顯著降低，而細胞核內Nrf2蛋白表達則顯著增多（胞質：F=26.62，P<0.05；胞核：F=29.88，P<0.05）。GSH檢測試劑盒檢測顯示，與對照組比較，PMA組和PMA+BST組細胞內GSH表達顯著增高，其中PMA組細胞內GSH表達顯著高于PMA+BST組（F=37.64，P<0.05）。細胞核內Nrf2與細胞內GSH表達成正相關（R2=0.908，P<0.05）。免疫熒光染色結果顯示，與對照組相比，PMA組和PMA+BST組細胞核內Nrf2蛋白表達增加，發生了核轉位，其中PMA組較PMA+BST組核轉位更為顯著。結論 PKC活化能夠促進RPE細胞抗氧化能力，其作用機制與PKC/Nrf2信號通路調節有關。

[關鍵詞]視網膜色素上皮細胞；蛋白激酶C；核因子E2相關因子2；谷胱甘肽

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）11（c）-0016-05

[Abstract] Objective To observe the expression status of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2） and glutathione （GSH） in retinal pigment epithelium （RPE） cells following the activation of protein kinase C （PKC） in rabbits. Methods Immunofluorescence staining was used to identify the original generation cultured RPE cells in rabbits. The third generation of RPE cells was divided into the control group （DMEM culture medium contains 15% fetal bovine serum， n=8）， the PMA group （DMEM culture medium contains 15% fetal bovine serum+4 μl 100 nmol/L PKC specific activator phorbol ester solution， n=8） and the PMA+BST group （pretreatment of RPE cells with 4 μl of 10 μmol/L Nrf2 inhibitor brusatol solution [BST] for an hour， aspirate and add DMEM culture medium containing PMA 4 μl of 100 nmol/L and 15% fetal bovine serum， n=8）， the incubation time of each group was 24 hours， Western-blot was used to detect the expression of Nrf2 protein in cytoplasm and nucleus. Then the GSH kit was used to detect the expression of GSH in RPE cells. And the correlation between the expression of Nrf2 in the nucleus and intracellular GSH was analyzed. Immunofluorescence staining was used to detect the translocation of Nrf2 protein in the cells. Results RPE cells showed melanin granules in the cytoplasm， long spindle-shape， and anti-human keratin （AE1/AE3） immunofluorescence staining showed strong positive. Western blot showed that the expression of Nrf2 protein in cell cytoplasm of the PMA group and the PMA+BST group were significantly down regulated compared with the control group， while the Nrf2 protein expression in cell nucleus was markedly up-regulated （all P<0.05）. Moreover，the difference in the expression of Nrf2 in cytoplasm and nucleus between the three groups was statistically significant （cytoplasm： F=26.62， P<0.05； nucleus： F=29.88， P<0.05）. GSH kit showed that， when compared with the control group， the intracellular expression levels of GSH in the PMA group and the PMA+BST group were significantly increased （all P<0.05）， and the GSH expression level of the PMA group was significantly higher than that of the PMA+BST group （P<0.05）. Nrf2 in the nucleus was positively correlated with GSM expression in the cell （R2=0.908， P<0.05）. Immunofluorescence staining showed that， compared with the control group， the Nrf2 protein expression in both the PMA group and the PMA+BST group was up regulated in the nucleus， and the nuclear translocation occurred， with more obvious nuclear translocation in the PMA group. Conclusion PKC activation can promote the antioxidant capacity of RPE cells， of which the mechanism of action is related to the regulation of PKC/Nrf2 signaling pathway.

[Key words] Retinal pigment epithelium； Protein kinase C； Nuclear factor erythroid 2-related factor 2； Glutathione

年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是眼科常見的導致老年人視力受損的疾病之一，研究已證實氧化應激對視網膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelium，RPE）所造成的損傷是AMD一個重要的發病機制[1-3]。近年來發現，轉錄因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是重要的氧化還原感受器，激活后可提高抗氧化基因的表達，從而達到抗氧化損傷的作用[4-6]。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是細胞內重要抗氧化物質，其表達水平揭示細胞的抗氧化能力[7-8]。在其他領域中有研究表明蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活能誘導Nrf2信號通路，發揮抗氧化應激作用[9-10]，但關于PKC/Nrf2信號在AMD疾病中的表達及作用尚不明確。本研究擬通過體外培養RPE細胞，并應用PKC激動劑PMA激活RPE細胞PKC表達，檢測RPE細胞Nrf2表達情況以及GSH表達水平，探討PKC活化對RPE細胞抗氧化的作用，并結合Nrf2抑制劑BST，闡明PKC/Nrf2信號對RPE細胞的作用機制。

1材料與方法

1.1材料、試劑與實驗動物

Nrf2抗、PKC抗體、AE1/AE3鼠抗人角蛋白抗體為美國Bioss公司產品，BST為加拿大TRC公司產品，細胞漿、核蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PMA為碧云天生物科技公司產品，胎牛血清為美國Hyclone公司；電泳儀、電泳槽為上海Tanon公司產品，倒置顯微鏡為日本OLYMPUS公司產品，倒置熒光顯微鏡為日本Nikon公司產品。青紫藍兔12只（24眼雌雄不限），體質量（2.5±0.5）kg，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供。

1.2方法

1.2.1兔RPE細胞的培養及鑒定 手術摘除兔眼球，經過無菌生理鹽水浸泡，PBS緩沖液沖洗后，去除眼球前節及玻璃體，制成眼杯，消化后收集細胞懸液，加入培養液接種、培養，傳代后，應用AE1/AE3鼠抗人角蛋白抗體免疫熒光染色方法進行細胞鑒定，鑒定為RPE細胞后進行分組實驗。

1.2.2實驗分組及給藥干預 取3代近乎融合的RPE細胞進行實驗，共計分為空白對照組（15%胎牛血清的DMEM培養液，n=8）、PMA組[15%胎牛血清的DMEM培養液+4 μl 100 nmol/L PKC特異激活劑佛波酯溶液（phorbol12-myristate13-acetate，PMA），n=8]、PMA+BST組[用4 μl 10 μmol/L Nrf2抑制劑鴉膽苦醇溶液（brusatol，BST）預處理RPE細胞1 h后，吸出并加入含PMA 4 μl 100 nmol/L的15%胎牛血清的DMEM培養液，n=8]，實驗各組培養24 h。

1.2.3 Western blot檢測 按細胞漿-細胞核蛋白提取試劑盒的方法提取各組樣品蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品濃度，計算蛋白質含量。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，12%分離膠），濕轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入Nrf2抗體（1∶1000），4℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶4000）孵育2 h后再漂洗。ECL化學發光法檢測，顯色后將膠片進行掃描，采用Image J圖像分析系統測定檢測蛋白表達的灰度值，分別計算量化試驗中蛋白表達的情況及樣品蛋白條帶/內參對照條帶的灰度值。

1.2.4免疫熒光檢測 將第3代細胞接種到預先放置蓋玻片培養皿中，培養24 h，4%多聚甲醛固定細胞20 min，Nrf2一抗稀釋液（1∶100），4℃孵育過夜，熒光二抗室溫下孵育1 h，用0.5 μg/ml DAPI避光孵育15 min，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.5 GSH試劑盒檢測 用GSH測定試劑盒提供相關試劑制備樣本溶液，置于96孔板，用酶標儀測定405 nm波長處的吸光度值（A值），將GSH溶液分別稀釋成50、25、15、10、5、2 mol/L，制作6個點標準曲線，再根據標準曲線計算樣本溶液的GSH濃度，對各組的RPE細胞內GSH表達水平進行檢測。

1.3統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，采用回歸方程和R2進行相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1體外培養兔RPE細胞的鑒定

原代RPE細胞呈球形，細胞質中可見黑色素顆粒（圖1A）。培養24～48 h細胞開始貼壁，集落樣生長呈不規則多角形，可見清晰透明的圓形細胞核及雙核細胞，胞質內含豐富黑色素顆粒（圖1B）。7 d左右細胞達到融合狀態，呈長梭形，排列致密（圖1C）。傳代24 h后貼壁，生長速度逐漸加快，每4～5天傳代。第3代RPE細胞經鼠抗人角蛋白（AE1/AE3）免疫熒光染色鑒定呈強陽性（圖1D）。

2.2 Western blot檢測RPE細胞胞核和胞漿Nrf2蛋白相對表達

與對照組比較，PMA組和PMA+BST組胞質內Nrf2蛋白表達顯著減少，胞核內Nrf2蛋白表達顯著增加，其中PMA組胞質內Nrf2蛋白表達較PMA+BST組顯著降低，而細胞核內Nrf2蛋白表達則顯著增多（胞質：F=26.62，P<0.05；胞核：F=29.88，P<0.05）（圖2、表1）。

2.3免疫熒光染色檢測Nrf2蛋白在RPE細胞內轉位情況

與對照組比較，PMA組和PMA+BST組RPE細胞核內Nrf2表達顯著增強，提示Nrf2發生了核轉位，其中PMA組較PMA+BST組核轉位更為顯著（圖3）。

2.4 GSH在RPE細胞內表達

與對照組比較，PMA組細胞內GSH表達顯著增高[（90.569±8.101） vs. （47.452±3.172）mol/L，P<0.0001]；PMA+BST組細胞內GSH表達亦增高[（71.245±5.317） vs. （47.452±3.172）mol/L，P<0.05]；其中PMA組細胞內GSH表達顯著高于PMA+BST組（F=37.64，P<0.05）；PMA組隨機抽取四組樣本，線性回歸方程檢測發現細胞核Nrf2及細胞內GSH表達成顯著正相關（R2=0.908，P<0.05）（圖4）。

3討論

AMD是一種局限于黃斑區的視網膜慢性進展性疾病，可引起患者視力喪失，并且隨著年齡的增長其發病率逐漸升高[11]。研究顯示，氧化應激誘發RPE細胞損傷在AMD的發生、發展機制中極為重要[12-13]，所以，如何減少RPE細胞的氧化損傷將對治療AMD起到重要作用。PKC是一大類磷脂依賴的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細胞內重要的信號傳導分子，在多種細胞內廣泛表達，通常是以無活性的形式存在于胞漿中，當被激活時，PKC會從胞漿向胞膜上移位，經過一系列復雜的磷酸化過程，產生相應的生物學作用[14-16]。高前應等[17]的實驗顯示，RPE細胞內PKC轉位及其活化與RPE細胞的凋亡及分裂、增生有關。最近的研究顯示，Nrf2是細胞內氧化還原穩態關鍵的調節因子，外源性或內源性氧化應激反應大多是通過Nrf2/Keap1通路來進行調節，在保護細胞氧化應激和損傷中起到重要的作用[18-19]。Zhang等[20]的研究顯示，對鉛暴露所致的神經細胞氧化損傷中，激活PKC蛋白激酶后，可對Nrf2蛋白磷酸化修飾，誘導Nrf2核轉位，啟動抗氧化應激反應抵抗氧化損傷。

本實驗結果顯示，與對照組比較，PMA組和PMA+BST組細胞漿內Nrf2蛋白表達顯著減少，而細胞核內Nrf2蛋白表達顯著增多，其中PMA組胞漿內Nrf2蛋白表達較PMA+BST組顯著降低，而細胞核內Nrf2蛋白表達增多顯著，可以證實RPE細胞在給予PKC特異激活劑PMA使PKC特異激活后，經過一系列的級聯反應，RPE細胞漿中的Nrf2發生了核轉位，使RPE細胞漿內的Nrf2蛋白表達減少，而細胞核內的Nrf2蛋白表達增多。PMA+BST組胞漿和胞核內Nrf2蛋白表達變化的原因可能與Nrf2抑制劑BST預處理RPE細胞后，使Nrf2蛋白分子結構中的絲氨酸/蘇氨酸發生了改變，導致PMA對RPE細胞內的Nrf2磷酸化水平降低有關。

綜上所述，本研究通過體外培養RPE細胞，應用PKC激動劑和Nrf2阻斷劑進行干預，對RPE細胞水平的相關信號通路、功能蛋白及抗氧化標志物進行檢測和定位，證實PKC活化能夠促進RPE細胞抗氧化能力，其作用機制可能與PKC/Nrf2信號通路調節有關，當PKC信號系統被激活后主要通過磷酸化Nrf2分子上的絲氨酸/蘇氨酸，使其與胞漿蛋白伴侶分子Kea1發生解離，導致Nrf2向核內轉位，在核內與抗氧化反應元件ARE相結合，促進抗氧化基因GSH表達增強，從而增強RPE細胞的抗氧化損傷的能力。本項研究為AMD的發病機制及臨床治療提供了一個新的理論依據，筆者將在后續實驗中通過體內動物損傷模型進一步證實此項理論的可行性，為AMD臨床治療提供新的治療思路。

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