肝郁脾虛證多發(fā)性抽動(dòng)癥大鼠模型的建立及評(píng)價(jià)

劉曉芳 薛小娜 王素梅 張 雯 衛(wèi) 利 王道涵 尹英敏

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院東方醫(yī)院,北京,100078; 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京,100029)

多發(fā)性抽動(dòng)癥(Tourette Syndrome,TS),是一種兒童精神科常見的神經(jīng)精神障礙性疾病[1]。肢體肌肉、面部肌肉及頸部肌肉或者患兒出現(xiàn)迅速、反復(fù)、不規(guī)則的抽動(dòng),為TS常見的臨床特征。TS往往有沖動(dòng)、強(qiáng)迫、多動(dòng)、注意力不集中等各種伴隨癥狀[2]。本病在臨床缺乏比較有效的治療,嚴(yán)重影響了患兒的身心健康,目前受到臨床醫(yī)生與社會(huì)公眾的極大關(guān)注[1]。隨著研究的進(jìn)展,目前迫切需求建立模擬小兒TS的動(dòng)物模型,進(jìn)行病因、病理機(jī)制、藥物篩選及藥效學(xué)等方面的評(píng)價(jià)研究,為揭示和有效診治TS提供研究工具。隨著中醫(yī)對(duì)TS的研究逐漸增多,目前模型不能很好反映中醫(yī)“辨證論治”思想精髓的缺點(diǎn)愈加突出。因此,本次實(shí)驗(yàn)擬建立TS大鼠模型的同時(shí),建立其中醫(yī)證型中的肝郁脾虛證,并對(duì)其以評(píng)價(jià),以便對(duì)中醫(yī)治療兒童TS有進(jìn)一步的深入研究。結(jié)合既往文獻(xiàn)及課題組前期實(shí)驗(yàn),依據(jù)中醫(yī)病因發(fā)病學(xué)原理,本課題組以亞氨基二丙腈(IDPN)腹腔注射誘導(dǎo)法后,用飲食失節(jié)、慢性束縛以及過度疲勞法建立TS肝郁脾虛證大鼠模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 30只3周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠(于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買,許可證編號(hào)為:SCXK(京)2012-0001),要求其重量在40～60 g。自由攝食飲水,保持相對(duì)的溫度及濕度,注意環(huán)境通風(fēng)(溫度控制在(22±2)℃,濕度控制在50%-70%)。

1.1.2 藥物 0.9%氯化鈉注射液(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):0906201w),10 mL每支;亞氨基二丙晴1瓶(美國(guó)Sigma-Aldrich，批號(hào):24859071)。

1.1.3 試劑與儀器 D-木糖酶測(cè)試分析試劑盒(南京建成生物科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):A035)；人胃泌素酶聯(lián)免疫分析試劑盒(江萊生物科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):2402503)；精密電子天平(美國(guó)雙杰兄弟集團(tuán)有限公司,JJ2000型)；自發(fā)活動(dòng)視頻分析系統(tǒng)(上海吉星軟件科技有限公司,DB018型)；DigBehv動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(SOFTRON,JLBehv-RRTM)；數(shù)碼攝錄一體機(jī)(HDR SR10E型,SONY)；微量振蕩器(北京拓普分析儀器有限公司,DEM-3)；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，Multiskan MK3)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將自由分籠喂養(yǎng)的大鼠分成3組,每組10只,分別標(biāo)注為肝郁脾虛組、空白組和模型組。讓各組大鼠自由飲水及進(jìn)食失誤,以12 h為白晝黑夜節(jié)律。將各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,參照全身用藥法[3]及前期課題實(shí)驗(yàn)結(jié)論[4-7],模型組及中醫(yī)證型組大鼠腹腔注射300 mg/(kg·d)的IDPN,空白組則在腹腔內(nèi)注射同等的氯0.9%化鈉注射液。各組均注射7 d,1次/d。

1.2.2 給藥方法 參考李艷彥等人的方法[8-10],從腹腔注射IDPN之日起,肝郁脾虛組大鼠于每天上午9:00置于束縛盒中限制其活動(dòng)3 h,下午3:00放于盛有溫水桶內(nèi)迫其游泳10 min左右。連續(xù)3周隔日給大鼠喂食。于造模第21天開始,停止上述造模因素,觀察其行為變化。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 自主活動(dòng)次數(shù)測(cè)定 每周對(duì)各組大鼠進(jìn)行1次自主活動(dòng)觀察,記錄大鼠15 min內(nèi)的自主活動(dòng)情況。

1.2.3.2 刻板運(yùn)動(dòng)觀察及評(píng)分 于造模后第1天、第7天、第14天、第21天、第28天進(jìn)行刻板運(yùn)動(dòng)觀察及評(píng)分。評(píng)分時(shí)間為2 min,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照前期研究[2]。

1.2.3.3 中醫(yī)證型評(píng)價(jià) 1)外觀變化:觀察各組大鼠活動(dòng)活躍度、毛色順滑、進(jìn)食量多少及大便次數(shù)的變化。2)重量測(cè)定:于實(shí)驗(yàn)第1天開始,每隔7天測(cè)定1次大鼠的重量。3)胃泌素及D-木糖酶定量測(cè)定:在實(shí)驗(yàn)第28天測(cè)定各組大鼠血清的胃泌素及D-木糖酶。在大鼠眼眶球后取1 mL血,加入無(wú)菌試管中。室溫靜置2 h后將其離心,冷凍保存。采用D-木糖酶測(cè)試分析試劑盒以及人胃泌素酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測(cè)其含量。4)脾臟與胸腺指數(shù):胃泌素及D-木糖酶定量測(cè)定后,對(duì)各組大鼠解剖,取其脾臟、胸腺。將各組器官分別稱重后,根據(jù)公式計(jì)算各組大鼠的胸腺及脾臟指數(shù)

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)測(cè)定 從實(shí)驗(yàn)第4天開始,除空白組外,其余組大鼠在受到外界各種刺激后,出現(xiàn)各種特殊行為,如直立、攀爬。實(shí)驗(yàn)第8天,除空白組外,其余組大鼠均出現(xiàn)不同程度的頭部抽動(dòng),同時(shí)舔、嗅、活動(dòng)增多等行為,部分大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為。

2.2 自主活動(dòng)儀檢測(cè) 空白組大鼠與其余組大鼠比較,自主活動(dòng)數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組與中醫(yī)證型組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的自主活動(dòng)

2.3 刻板運(yùn)動(dòng)觀察評(píng)分 模型組與肝郁脾虛組比較未見明顯差異(P>0.05)。除空白組外,其余各組大鼠第28天與第7天比較,其刻板運(yùn)動(dòng)有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠刻板運(yùn)動(dòng)評(píng)分分)

2.4 中醫(yī)證型測(cè)定與評(píng)價(jià) 肝郁脾虛組大鼠造模后開始出現(xiàn)煩躁易怒的狀態(tài)。3周后,肝郁脾虛組

表3 各組大鼠體重比較

大鼠逐漸出現(xiàn)活動(dòng)及飲食減少,情緒低落,體重增加緩慢(P<0.05),大便次數(shù)增多,質(zhì)地較稀的癥狀。見表3。

2.5 胸腺及脾臟指數(shù)測(cè)定 肝郁脾虛組以及模型組與空白組比較,其胸腺、脾臟指數(shù)差異分別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肝郁脾虛組大鼠與模型組大鼠之間比,各組指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠胸腺及脾臟指數(shù)比較

2.6 D-木糖濃度測(cè)定與胃泌素測(cè)定 中醫(yī)證型組大鼠與其余各組比較,其D-木糖濃度測(cè)定與胃泌素測(cè)定差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 胃泌素及D-木糖濃度

3 討論

多年來(lái),本課題組一直致力于小兒TS的臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。導(dǎo)師王素梅教授認(rèn)為,小兒TS病機(jī)多屬土虛木亢,風(fēng)痰內(nèi)擾,臨證時(shí)采用扶土抑木法從肝脾論治,取得一定療效。課題組利用“名老中醫(yī)臨床診療信息采集系統(tǒng)”及名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)智能分析平臺(tái),對(duì)王素梅教授于2005年10月至2006年5月之間建立的102例TS病歷,進(jìn)行信息結(jié)構(gòu)化、數(shù)據(jù)分析,結(jié)果表明:共757次診次中,中醫(yī)辨證分型以肝郁脾虛最多見,共334例次,占44.12%[11-13]。課題組通過文獻(xiàn)查閱亦發(fā)現(xiàn),抽動(dòng)癥患者以肝郁脾虛型為最多見。因此,本課題組認(rèn)為,建立TS肝郁脾虛證動(dòng)物模型對(duì)本病的中醫(yī)辨證論治有著重大意義。

參照文獻(xiàn)及SD大鼠本身的特點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)造模方法基于以下考慮:動(dòng)物在慢性束縛中,其活動(dòng)被禁,引起情緒受抑,情志不遂,氣機(jī)不暢,導(dǎo)致肝郁;迫其每日游泳活動(dòng)10 min,使有勞累感;給予飲食的時(shí)而增加與時(shí)而缺失類似饑飽失調(diào),兩者相加,與中醫(yī)的飲食勞倦類似,導(dǎo)致脾胃受損。本次實(shí)驗(yàn)過程中觀察到,肝郁脾虛證的大鼠體重有明顯的減輕,其外觀表證發(fā)生明顯的變化。除了出現(xiàn)頭部抽動(dòng)、旋轉(zhuǎn)行為外,大鼠由開始的易怒煩躁轉(zhuǎn)為情緒低落,同時(shí)飲食減少,大便由正常轉(zhuǎn)為稀溏;活動(dòng)漸少,體重增加緩慢,與中醫(yī)臨床中肝郁脾虛證型表現(xiàn)出的癥狀較接近。

脾臟與胸腺的功能,對(duì)動(dòng)物有重要意義。脾臟與胸腺的各種改變,目前認(rèn)為是中醫(yī)脾虛證的病理學(xué)依據(jù)之一[14-15]。本次實(shí)驗(yàn)中,中醫(yī)證型組動(dòng)物的脾臟與胸腺指數(shù)與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與模型組大鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明模型組與肝郁脾虛組大鼠均有免疫力的下降。

胃泌素在人體及動(dòng)物的消化系統(tǒng)中有重要作用。目前有相關(guān)文獻(xiàn)表明,其水平下降程度與肝郁脾虛證的嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性[16]。本實(shí)驗(yàn)中統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異性,說明本脾虛證TS模型具有胃蠕動(dòng)減弱的病理基礎(chǔ)。血清D-木糖含量水平的變化可以較客觀地反映兒童的消化吸收代謝功能,是一個(gè)與機(jī)體的小腸吸收功能有正相關(guān)性的檢測(cè)指標(biāo)。血清D-木糖水平的變化可以客觀地反映人體的消化功能[17-19]。從中醫(yī)角度而言,脾失健運(yùn),無(wú)法運(yùn)化水谷精微,使機(jī)體無(wú)法吸收其精華。表現(xiàn)在生物學(xué)糖代謝方面,則會(huì)出現(xiàn)D木糖數(shù)值降低。本次實(shí)驗(yàn)中中醫(yī)證型組大鼠與其余各組大鼠比較統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異性,說明其具有腸道吸收功能減弱的表現(xiàn)。

SD大鼠腹腔注射IDPN所誘導(dǎo)的TS模型抽動(dòng)癥狀穩(wěn)定,表面效度良好,可維持較長(zhǎng)時(shí)間[20-22]。結(jié)合飲食失節(jié)、慢性束縛以及過度疲勞法建立肝郁脾虛證TS大鼠模型,具有兒童TS中醫(yī)證型中的肝郁脾虛證的相似癥狀。但根據(jù)兒童TS的臨床表現(xiàn),其生物學(xué)特性目前存在一定的差距,且本次實(shí)驗(yàn)尚缺乏對(duì)肝郁癥的生物學(xué)檢查方法和相關(guān)指標(biāo),我們將在下一步的深入研究中繼續(xù)探索以彌補(bǔ)本次不足。