逍遙丸指紋圖譜和摻偽檢驗方法的建立

姚立山 郝滿霞

(鄭州大學附屬醫院南陽中心醫院中藥科，南陽，473009)

在國家藥品評價抽樣、常規藥材市場調研進行薄荷藥材的抽檢考察中發現，薄荷存在同科的留蘭香代用或者混用的情況[1-3];逍遙丸的主要適應證是肝郁氣滯及脾虛血虛的患者，其出處為宋代《太平惠民和劑局方》，方中以柴胡疏肝解郁，恢復肝臟條達、疏泄之性，當歸、白芍養血柔肝濡養肝臟，增強其藏血之功；白術、茯苓健脾去濕，后天之本得以鞏固，患者神疲癥狀減輕，《靈樞·平人絕谷篇》有云：“神者，水谷之精氣也”。脾運化有權，統氣血有司，脾土養肝，緩肝氣橫逆之脅痛；炙甘草甘以緩急，合生姜共奏有益氣補中之效；薄荷少許，助瀉肝郁之熱[4-5]。而目前由于現代中青年工作壓力較大，以及老齡化人口的日益增加，普遍存在肝郁氣滯、脾虛血虛的情況，因此大眾對于服用逍遙丸，疏肝健脾，養血和血的需求較大[6-8]；因此，薄荷作為逍遙丸中重要的藥材之一，控制好逍遙丸的質量，預防在逍遙丸制作完成之前的基礎藥材存在摻偽的情況，尤其關鍵。薄荷和留蘭香屬于同科同屬的植物，兩者均屬于唇形科植物，性狀相近，因此無法在顯微鏡下鑒別[9]；然而兩者的主要成分和主治功效卻大相徑庭，薄荷主要成分是薄荷腦，主要功效為疏肝行氣，瀉肝郁之熱[10]；而留蘭香的主要成分是香芹酮，主要功效為解表和中[11]。目前薄荷藥材的檢查項中沒有香芹酮的檢查項，比較不容易發現藥材本身是否存在摻偽的問題，故本研究采集3個不同廠家各2個不同批次的逍遙丸進行檢驗，以薄荷腦和香芹酮為對照品，旨在采用指紋圖譜分析逍遙丸的同時，建立其摻偽檢驗方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 氣相色譜儀(型號:7890 A，AGILENT安捷倫科技有限公司);全自動智能內校分析天平(型號:PTY124，福州普力斯特科學儀器有限公司)。

1.2 試劑 由中國食品藥品檢定研究院提供的批號為0728-200005薄荷腦；由德國Dr.Ehrenstorfer GmbH研究所提供的批號為00610的香芹酮；以及分析純購于Fisher scientific公司。

1.3 分析樣品 取3個不同廠家(A廠家:仲景宛西制藥股份有限公司;批準文號:國藥準字Z41021831;B廠家:九芝堂股份有限公司;批準文號:國藥準字Z43020469;C廠家:蘭州佛慈制藥股份有限公司;批準文號:國藥準字Z62020890)的逍遙丸，每個廠家各取2批不同生產批次的逍遙丸用研磨器研細,精密取2 g逍遙丸粉末。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

為進行摻偽檢驗方法建立，采用2種色譜方法進行檢測，具體如下。

2.1.1 氣相色譜與質譜聯用法(GC-MS法) 采用質譜檢測器，EI源，同時選用5%二苯基95%二甲基聚硅氧烷固定液(HP-5MS)毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，毛細管柱的進樣口溫度為200 ℃；柱溫為程序升溫，具體升溫程序為初始溫度90 ℃，以3 ℃/min升溫至246 ℃，以30 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min，最后以FID檢測器溫度為300 ℃，全掃描方式，m/z 20～1 000，柱流量1 mL/min，進樣量1 μL，不分流。

2.2.2 氣相色譜法(GC) 采用DM-5(5%二苯基95%-二甲基聚硅氧烷固定液)毛細管柱(30 m×0.53 mm×1.5 μm)，其進樣口溫度200 ℃，程序升溫(同2.2.1)，柱流量3 mL/min，進樣量1 μL，不分流。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取薄荷腦和香芹酮對照品，分別加分析純(乙酸乙酯)制成每毫升含50 μg的對照溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取逍遙丸粉末0.5 g，加入200 mL水的揮發油測定容器中，充分搖勻，待粉末完全溶于水后加入2 mL分析純(乙酸乙酯)，參照《中華人民共和國藥典2010版一部附錄XD》[12]中揮發油測定的方法使揮發油測定容器保持微沸狀態2 h，取乙酸乙酯層作為供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 取同一供試品溶液根據2.3制備的供試品溶液各5 μL，采用薄層層析方法(TLC)對逍遙丸進行專屬性試驗，分別點與同一片硅膠G薄層色譜板，展開劑的配比為19環乙烷：1乙酸乙酯，經過展開后，取出硅膠G薄層色譜板并晾干，隨即將含有2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液噴在色譜板上，加熱100 ℃，5 min后將色譜板放置于365 nm的紫外光燈下觀察，專屬性試驗結果顯示逍遙丸的專屬性良好。

2.5 線性關系考察 精密量取混合對照品溶液3、6、12、18、24 mL，分別置50 mL量瓶中，記錄峰面積；以混合對照品進樣量(μg)為橫坐標(X，峰面積積分值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，結果表明，薄荷和香芹酮混合對照品溶液在0.060 21～0.113 48 μg范圍內線性關系良好。

2.6 中間精密度試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，連續進樣5次，結果顯示相對標注偏差RSD是0.91%，精度度良好。

2.7 供試品溶液穩定性試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，配置后分別放置0、2、4、8、16、24、48 h后進樣檢測，結果顯示48 h內供試品溶液基本穩定，RSD是0.94%。

2.8 重復性試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，在相同色譜條件，相同分析儀上檢測5次，結果顯示標準偏差RSD為0.90%，重復性良好。

2.9 回收率試驗 采用加樣回收法，精密稱取6份已知含量的同一批號樣品各約0.5 g，分別精密加入20 mL混合對照品溶液，進行回收率試驗測定，計算結果顯示平均回收率為99.35%，RSD為0.86%。

2.10 樣品測定結果

2.10.1 GC色譜圖 如圖1顯示A廠逍遙丸供試品中未檢出香芹酮，而B、C廠均檢測出含有香芹酮，且C廠香芹酮PA值高于B廠。

2.10.2 逍遙丸GC-MS色譜圖 根據GC-MS色譜圖，采用正離子方式掃描，結果顯示，薄荷腦和香芹酮的GC-MS特征離子峰分別是m/z 41、55、71、81、95和m/z 39、54、82、93、108。見圖2。

表1 逍遙丸中薄荷腦和香芹酮含量測定(mg/g)

3 討論

3.1 摻偽方法建立的必要性 市場上售賣的薄荷藥材處理方式都是揉碎薄荷葉子，因此單純從藥材性狀上很難和同科同屬的留蘭香進行顯微鑒別[13]，根據薄荷和留蘭香的主要成分不同，薄荷主要成分為薄荷腦，并不含有香芹酮[14]，因此本研究首先通過薄層層析法(TLC)對薄荷腦和香芹酮進行專屬性試驗，進行直接鑒別。當通過TLC明確薄荷腦和香芹酮的專屬性后，根據《中華人民共和國藥典》附錄規定薄荷和留蘭香屬于同科同屬植物，在種植的時候容易混入，因此允許的雜質最高限度是5%[15]，研究進一步采用GC法對逍遙丸中薄荷腦和香芹酮進行成分指紋圖譜分析，結果顯示A廠未檢測出香芹酮，而B、C廠均檢測出程度不等的香芹酮含量。為了進一步確證，研究采用GC-MS法進步對逍遙丸進行指紋圖譜分析，在GC-MS質譜圖中，與對照品色譜比較，供試品色譜圖不可以出現保留時間相同的色譜峰;若出現保留時間相同的色譜峰，則其一級質譜不得與對照品的一級質譜一致[16-18]。

3.2 展開劑和顯色劑的選擇 在專屬性試驗TLC法中展開劑和顯色劑的選擇尤為重要，其中展開劑的選擇能夠更好的讓目標成分更好的與周圍的干擾斑點分開[19]，在本研究的前期試驗中曾采用甲苯-乙酸乙酯(19∶ 1)、環己烷-乙酸乙酯(10∶ 1)、環己烷-乙酸乙酯(10∶ 2)、環己烷-乙酸乙酯(19∶ 1)為展開劑，結果選用環己烷-乙酸乙酯(19∶ 1)色譜效果最理想，香芹酮與周圍干擾的斑點可以分開。

而由于薄荷和留蘭香是同科同屬植物，薄荷藥材中與香芹酮Rf值相近的位置斑點顏色與香芹酮類似，可能會引起誤判，研究前期試驗中曾使用5%香草醛硫酸溶液作為顯色劑[20]，置熒光下檢視，未能將香芹酮斑點與周圍干擾斑點明確區分開，而采用2%對二甲氨基苯甲醛作為顯色劑時香芹酮斑點顏色與周圍斑點顏色明顯有區別。

圖1 逍遙丸GC色譜圖

注：1為薄荷腦；2為香芹酮

圖2 逍遙丸GC-MS色譜圖

3.3 毛細管柱的選擇 采用氣相色譜儀分析逍遙丸指紋圖譜中GC法和GC-MS法中毛細管柱的選擇尤其重要，其耐用性決定后續中精密度、穩定性、重復性和結果可靠性的關鍵因素[21-23]，在GC法中選擇DM-5(5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷固定液)毛細管柱和在GC-MS法中選擇HP-5MS(5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷固定液)毛細管柱，2種毛細管柱均具有良好的分離度和塔板數，表明本研究中逍遙丸指紋圖譜選用的毛細管柱耐用性良好。

3.4 方法嚴謹性考察意義 指紋圖譜中線性考察的意義在于分析樣品在某一個濃度或峰高(面積)情況是否是成線性的,根據朗伯比爾定律，待測樣品面積與濃度在這個線性范圍內成正比，分析結果才是準確的[24]。而加樣回收率包括絕對回收率和相對回收率,其中相對回收率有一種是回收試驗法,另一種是加樣回收試驗法[25]。而本研究的目的主要是為了考察指紋圖譜檢測方法的嚴謹性,因此需要分析相對回收率，故而選用加樣回收試驗法,即在已知濃度樣品中加入藥物,并與標準曲線作比較。