三黃湯治療2型糖尿病的分子機制研究

段玉紅 高 泓 蘇虹霞

(1 陜西中醫藥大學附屬醫院內分泌二科，咸陽，712000; 2 成都中醫藥大學附屬醫院科研科，成都，610075)

糖尿病嚴重威脅人類健康，發病率逐年上升，成為威脅人類健康的慢性疾病之一。中醫認為糖尿病的發病機制比較復雜，而且也受自身體質、生活環境、飲食等因素的影響，使其病機十分復雜[1-2]。在糖尿病的分類中，大約95%為2型糖尿病(T2DM)，其為代謝異常綜合征。主要由環境因素和遺傳因素導致的復雜疾病。面對T2DM及其并發癥給患者帶來的危害，預防和治療T2DM成為研究的熱點[3]。目前，隨著中醫藥的不斷發展，人們對中藥的認識和信任，使糖尿病的治療有了新的突破。大黃、黃連、知母等多種中藥及復方都具有降糖作用，而且不良反應少。其降糖機制具有多成分-多靶點-多通路等特點，影響糖代謝、胰島素分泌、改善臨床癥狀、修復胰島B細胞等達到降糖效果[4-6]。依據T2DM的發病機制，確立了清熱解毒、泄毒、瀉火的治療方法，基于文獻及經典方劑選取三黃湯進行研究。

三黃湯由黃連、黃芩、大黃組成，出自《傷寒論》瀉心湯方。方中黃連、黃芩、大黃為典型寒性中藥，黃連、黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒之功，兩者相須為用，增強清熱燥濕之功，共為君藥。大黃具有清熱瀉火、瀉下攻積、涼血解毒等功效。黃連、黃芩、大黃共用可清三焦之熱，相輔相成。因此本研究選擇三黃湯辨治組方思路與降糖、降脂的研究思路相一致。已經有相關報道三黃湯對T2DM有較好的治療作用[7]，但其發揮作用的主要化學成分及靶點并不明確，所以本研究基于網絡藥理學平臺篩選三黃湯發揮作用的有效化學成分，采用CTD篩選T2DM的靶標基因。通過DAVID 6.8對靶標基因進行分子功能分析，同時通過STRING進行基因相互作用分析，篩選T2DM的關鍵靶標基因，基于分子對接技術對關鍵靶標進行驗證。并采用Cytoscape 3.5.1軟件構建三黃湯成分-關鍵基因網絡模型。明確三黃湯中14種化學成分通過相互協同治療T2DM。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 三黃湯化學成分 基于中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)在Herb name中進行查找黃連、黃芩、大黃的化學成分[8-9]。基于CTD(http://ctdbase.org/)篩選T2DM的靶標基因。參照Lipinski′s五規則，選擇同時滿足-2≤ALogP≤5，OB≥50%，DL≥0.18，MW≤500篩選三黃湯有效化學成分。

1.1.2 靶點分子功能 基于DAVID6.8生物信息學數據，該數據庫可以對靶標蛋白或基因進行分子功能、生物過程、細胞成分等分析。

1.1.3 基因相互作用 STRING(https://string-db.org/)，將2型糖尿病(Diabetes Mellitus,Type 2)中的30個基因輸入到STRING中，對30個基因之間的相關性進行分析。

1.1.4 分子對接 iGEMDOCK操作相對比較簡單，而且對接范圍比較廣，也可以用于金屬對接。

1.2 方法

1.2.1 三黃湯化學成分篩選 相關參數設置為口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥50%,類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18，-2≤脂水分配系數(ALogP)≤5分子量(Molecular Weight,MW)≤500。在TCMSP中下載小分子MOL2結構，采用Open Babel-2.4.1構建成三維結構，對其加氫、加電荷。Open Babel為開源軟件，一般用來進行多種分子結構文件格式的相互轉換，也可以計算結構描述參數。

1.2.2 T2DM的靶點篩選 在Diseases(疾病)中輸入2型糖尿病(Diabetes Mellitus,Type 2)或D003924。進行檢索，選擇參考數(Reference Count)大于等于130作為T2DM靶標基因。靶標基因包括：基因名稱(Gene Symbol),基因ID(Gene ID),疾病名稱(Disease Name),疾病ID(Disease ID),參考數(Reference Count)相關信息。

1.2.3 潛在靶點分子功能分析及構建分子功能-靶點網絡模型 在線打開DAVID Bioinformatics Resources 6.8，將基因ID(Gene ID)輸入到基因列表(Gene List)中，相關參數選擇為：基因ID(GENE_ID)，List Type(列表類型)：Gene List(基因列表)。最后選擇提交列表(Submit List)。同時，基于Cytoscape 3.5.1軟件[10]建立分子功能-靶點網絡模型。網絡包括活性成分、靶點2類節點。若某一靶點為某化合物的潛在作用靶點，則以邊(edge)相連。

1.2.4 基因相互作用分析 輸入30個基因名稱(Gene Symbol)，來源(Organism):人源(Homo sapiens)，進行相互作用分析。

1.2.5 關鍵靶點分子對接 小分子支持PDB，MOL和MOL2 3種格式。對接后的結果以氫鍵(H),電荷能(E)和范德瓦爾力(V)等作用統計，并將能量轉換成單位kcal/mol[11-13]。將三黃湯和陽性藥共15化學成分與關鍵靶標進行對接。相關參數設置：解的個數(Number of solution)：2，子代(Generation)：70，群體大小(generic evolutionary method)：200。

2 結果

2.1 三黃湯有效化學成分 黃連活性成分5個，大黃活性成分2個，黃芩活性成分7個。見表1。

表1 三黃湯化學成分

2.2 靶標基因 基于CTD數據庫查找T2DM的潛在靶點30個。見表2。

表2 T2DM的靶標信息

2.3 潛在靶標分子功能 30個基因進行分子功能富集分析，選擇靶標基因顯著發揮作用的分子功能(P<0.05)，涉及的主要分子功能:亞鐵血紅素結合(Heme Binding)，酶結合(Enzyme Binding)，蛋白酶結合(Protease Binding)，轉錄因子結合(Transcription Factor Binding)，蛋白質結合(Protein Binding)等。即三黃湯治療T2DM可能主要通過8項分子功能的相關靶標分子發揮治療作用。采用Cytoscape 3.5.1軟件建立分子功能-靶點網絡模型，發現NFKB1A，BCL2，TNF，RELA，TGFB1，PPARG，HMOX1 7個基因涉及到4項及4項以上的分子功能。發揮重要作用，為主要靶標基因，將進一步進行分子對接分析。見圖1。

2.4 潛在靶標相互作用 30個基因之間的相互作用關系采用STRING軟件進行分析，獲取衡量網絡的拓撲參數。每一個節點代表一個基因，基因名稱位于節點右上方，邊(edge)表示基因和基因之間的功能性關聯，其顏色不同代表不同的作用關系。相關參數為：節點數(Number of Nodes):29，邊數(Number of Edges):304，平均節點度(Average Node Degree):21，avg.局部聚類系數(Avg.local Clustering Coefficient):0.873，預期邊緣數(Expected Number of Edges):79,PPI富集p值(PPI Enrichment p-value):<1.0e-16。相互作用結果和分子功能分析結果相一致，NFKB1A，BCL2，TNF，RELA，TGFB1，PPARG，HMOX1 7個基因的degree≥15。整個網絡以NFKB1A，BCL2，TNF，RELA，TGFB1，PPARG，HMOX1等靶標基因為中心進行相關聯，去掉關鍵基因，整個網絡渙散。見圖2。

圖1 分子功能-靶標作用網絡

注：紅色節點表示分子功能，藍色節點表示靶標，黃色節點表示degree≥4的關鍵靶標

圖2 基因相互作用

注：紅線：融合的證據；綠線：共同相鄰蛋白；藍線：證據存在；紫色：實驗室數據；黃線：文獻檢索；淡藍色：相關性聯系；黑色：共表達

圖3 三黃湯多成分-關鍵靶點網絡模型

注：紅色-關鍵靶標，藍色-化學成分

2.5 靶標驗證 選擇T2DM關鍵靶標(BCL2,PPARG，HMOX1)基因與三黃湯14個有效化學成分進行分子對接。靶標基因的三維結構下載于PDB數據庫。分別為BCL2(4MAN)，PPARG(3U9Q)，HMOX1(1N45)。表3列出三黃湯化學成分與關鍵靶標對接后的數值。評價標準以結合能(affinity)為主，結合能越小越穩定。為了使結果更清晰，構建了化學成分-靶點網絡圖(圖3)，其中13個化學成分與PPAR結合，(R)-Canadine為結合能量最低；4個化學成分與BCL2結合，NEOBAICALEIN為結合能量最低；14個化學成分與HMOX1結合，NEOBAICALEIN為結合能量最低。

3 討論

T2DM的發病率逐年上升，與肥胖、血脂異常、代謝異常等諸多疾病關系密切。影響人們的身心健康，所以預防和治療T2DM當今難題[14]。目前，主要采用調節胰島素、控制血糖等進行治療，但是往往會出現一些不良反應及并發癥[15]。三黃湯(黃連、大黃、黃芩)為臨床清熱燥濕常用方劑，藥理作用廣泛，人們對三黃湯藥理作用機制研究逐漸深入。而三黃湯對糖尿病的治療臨床上有較好的效果，但是機制不明確，本研究初步篩選T2DM的關鍵靶標，對其關鍵靶標進行深入研究。對接結果發現三黃湯中的14個有效化學成分，13個化學成分與PPAR結合，4個化學成分與BCL2結合，14個化學成分與HMOX1結合。因此，三黃湯中14種化學成分通過相互協同治療T2DM。Bcl2(BCL2,Apoptosis Regulator)是主要的細胞凋亡調控基因。已經有研究表明,與空白對照組比較，模型組(2型糖尿病)大鼠胰腺Bcl2基因表達降低[16]。葡萄糖與胰島B細胞相互影響，長時間處于高葡萄糖狀態，導致B細胞的凋亡，其凋亡與BCL基因家族中的平衡相關；血紅素加氧酶1(HMOX1)為降解血紅素的限速酶[17-18]。主要在細胞增殖、氧化、凋亡等方面發揮重要作用，已經有報道HMOX1對脂肪細胞的分化有調節作用。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)主要調節脂肪的生成[19]。HMOX1和PPAR-γ相互影響，PPAR-γ的異位表達影響脂肪細胞分化，HMOX1表達不斷降低。BCL2,PPARG，HMOX1在2型糖尿病的發生、發展中起到了關鍵作用。

表3 三黃湯與關鍵靶標對接結果(kcal/mol)