加味四君子對宮頸癌大鼠模型癌組織中Caspase-3、Caspase-7、Survivin表達的干預作用

王 劍 張 軼 劉月芬 毛寶宏 王文第 劉 青

(1 甘肅省婦幼保健院婦幼保健科研中心,蘭州,730050; 2 蘭州生物制品研究所有限責任公司,蘭州,730046)

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一,僅有少數患者早期出現陰道分泌物異常、陰道接觸性出血等癥狀,大部分患者并未出現任何臨床癥狀,直至晚期因癌組織浸潤其他組織器官出現繼發性癥狀時疾病才被發現,具有極強的隱匿性[1]。因此探尋特異性指標做到盡早發現疾病是目前臨床研究的重點。中醫藥的抗癌效果逐漸得到認可,四君子湯有益氣健脾之功,首載自《太平惠民和劑局方》,臨床不乏四君子湯加減有效抗腫瘤的報道[2-4],但其作用機制目前尚無統一定論,一定程度限制了其臨床的推廣應用。基于此,我們亦宮頸癌模型大鼠為研究對象,進行加味四君子湯干預,臨床應用提供數據參考,具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Wistar雌性大鼠30只均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(合格證:S20089382),平均值中(155±15)g,鼠齡均為6周。飼養于蘭州生物制品研究所SPF動物房中心,飼養環境設置:溫度22～24 ℃，平均溫度(22±1.28)℃,濕度53%～55%,平均濕度(54±0.27)%。所有Wistar進行為期3 d的適應性喂養,隨后將30只大鼠隨機分為空白組10只,造模組20只,其中造模組大鼠接受宮頸癌模型制備,造模后隨機分為模型組和干預組。3組大鼠在鼠齡、體重方面比較，差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

1.1.2 藥物 加味四君子湯詳方如下:人參12 g、白術9 g、茯苓9 g、半枝蓮9 g、金銀花9 g、香附6 g、黃柏6 g、鳳尾草6 g、甘草3 g,所有中藥均購自四川拓荒牛中藥材種植有限公司,水煎備用。

1.1.3 試劑與儀器 人宮頸癌Hela細胞株(購自中國醫學科學院基礎研究所),10%水合氯醛(購自青島宇龍海藻有限公司,國藥準字H37022673),4%多聚甲醛(購自武漢百浩天生物科技有限公司),-actin、Caspase-3、Caspase-7、Survivin一抗抗體(均購自美國CST公司),BCA蛋白定量試劑盒(購自碧云天生物有限公司),DAB試劑盒(購自Solarbio公司),RPMI-1640培養液(購自江萊生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將人宮頸癌Hela細胞株置于RPMI-1640培養液進行培育,將培養瓶置于37 ℃體積分數為5%的CO2飽和濕度環境中,當細胞生長至對數期時加入適量的0.25%的胰酶進行消化,充分消化后用小牛血清培養基終止消化,將細胞液置于4 ℃離心機中1 500 r/min離心10 min,充分洗滌后將細胞計數調整為107個/mL。將大鼠置于無菌手術操作臺,在大鼠腋窩皮下組織注射0.5 mL人宮頸癌Hela細胞懸液,常規飼養7 d后大鼠出現明顯的腫瘤結節提示造模成功,反之則提示造模失敗[5]。本研究對20只大鼠進行模型制備,其中2只大鼠未出現腫瘤結節,提示造模失敗,將18只造模成功大鼠隨機分為模型組及干預組，每組9只。

1.2.2 干預方法 干預組大鼠每天接受加味四君子湯灌胃,以150 mg/kg·d劑量進行干預,所有大鼠均只有飲食且術后飼養環境相同。1劑/d,空白組及模型組大鼠僅每天接受模擬抓取,并用等體積的生理鹽水灌胃。各組大鼠均連續干預8周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 宮頸癌病灶大小 對模型組及干預組大鼠的宮頸癌病灶大小進行測量,記錄長、寬、高的數據,并計算出體積。

1.2.3.2 Western blotting法檢測Caspase-3、Caspase-7濃度變化 干預結束后各取模型組及干預組各3只大鼠的腫瘤組織50 mg,空白組3只大鼠腋窩皮下組織50 mg。分別加入蛋白裂解液將組織的充分裂解勻漿,用BCA試劑盒對各樣本的蛋白濃度進行測定,隨后將樣本在水浴中進行蛋白變性,取出適量樣本進行SDS-PAGE電泳跑膠,隨后進行轉膜、內參及Caspase-3、Caspase-7抗體孵育,隨后將目標PVDF膜充分洗滌后進行二抗孵育,加入ECL顯影液后進行圖片顯影,讀取OD值,并用Image(BIO-RAD公司)的圖像處理軟件進行數據處理。

1.2.3.3 免疫組化法檢測Survivin水平變化 干預結束后隨機抓取各組3只大鼠腹腔注入10%水合氯醛充分麻醉后腹主動脈灌注4%多聚甲醛進行組織固定,模型組及干預組取出腫瘤組織,空白組取腋窩皮下組織,進行組織脫水、包埋、切片、固定,隨后將切好的組織片進行脫蠟,在進行抗原修復、加入內源性過氧化物酶阻斷劑,隨后用PBS沖洗,避光環境下加入DBA溶液進行顯色,調整顯色時間后用自來水將DAB沖洗干凈,封片,顯微鏡下讀片,每張載玻片片隨機選擇5個視野進行觀察并計算。

2 結果

2.1 宮頸癌病灶大小的變化 空白組未出現宮頸癌病灶,模型組病灶體積(1 573.48±11.24) mm3,干預組病灶體積(683.23±4.81) mm3,各組宮頸癌病灶大小差異有統計學意義(P<0.05),干預組明顯較模型組小。見表1。

表1 各組宮頸癌病灶大小

圖1 各組Caspase-3、Caspase-7 Western blot電泳結果

組別Caspase-3/內參IOD比值Caspase-7/內參IOD比值空白組4.723±1.0213.634±0.035模型組1.162±0.1370.479±0.223干預組2.571±1.1261.984±0.121Z8.2874.323P0.0030.002

圖2 各組Survivin濃度的變化

組別Survivin光密度空白組34.382±1.281模型組502.132±0.932干預組212.531±1.281Z7.243P0.025

2.2 各組大鼠Caspase-3、Caspase-7、Survivin濃度變化 2組接受造模術大鼠Caspase-3、Caspase-7濃度均有不同程度下調,Survivin表達升高,其中干預組大鼠經過為期8周的干預后Caspase-3、Caspase-7濃度上調,Survivin濃度下降,干預組改善明顯優于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、圖2及表2、表3。

3 討論

宮頸癌是目前臨床常見的婦科惡性腫瘤,手術在早期介入有較理想的臨床療效,但該病發生發展隱匿,多數患者發現疾病時依然處于中晚期,喪失了手術最佳時間窗,由此新輔助化療成為中晚期宮頸癌的主要治療手段[6],然而通過長期的臨床觀察我們發現,雖然化療藥物可直接作用于瘤體抑制其生長,但與此同時帶來的不良反應亦給患者造成了嚴重的影響,阻礙了治療依從性。中醫藥以其療效顯著,安全性高等諸多優勢被逐漸運用于抗癌臨床治療中,中醫認為宮頸癌屬于“崩漏”“帶下”“癥瘕”等范疇,《黃帝內經》云:“正氣存內、邪不可干”“蓋沖任失調,督脈失司,帶脈不固,因而帶下”。宋代醫學家陳自明在其代表作《婦人大全良方》寫道:“產后血氣傷于臟腑,臟腑虛弱為風冷所乘,搏于臟腑,與氣血相結,故成積聚瘢塊也”。由此不難看出氣血虧虛是宮頸癌發生發展的主要病因,婦人機體正氣虧虛,臟腑功能失調,外邪趁虛而入,或因寒濕,或因痰瘀,侵襲胞宮,脈絡阻滯,郁久化熱,熱瘀毒郁結于宮頸而成此病,故健脾益氣,清熱解毒,化瘀散結是治療本病的關鍵[7]。本研究在四君子湯基礎上加用清熱解毒散瘀之品,方中人參益氣健脾養胃,氣血生這正氣充盈;白術健脾燥濕,加強人參的益氣之功;茯苓甘淡滲濕,白術、茯苓合用促使健脾祛濕之功倍增;方中半枝蓮、金銀花以清熱解毒,香附首載于陶弘景的《名醫別錄》,有理氣之功,是氣病之總司,女科之主帥。黃柏有清熱解毒的功效,如膀胱、大腸經,可清除下焦濕熱,《神農本草經》描述到:“主五臟腸胃中結熱,女子漏下赤白,陰傷性疾”。鳳尾草味淡微苦,主入大腸經及心經,《分類草藥性》曰:“鳳尾草,可主一切熱毒之疾,可消腫清火也”,是專治婦人疾病之良品。甘草可調和諸藥藥性,又可健脾胃以固中氣之虛羸,調和陰陽以平衡營衛之勢。整方共奏益氣健脾,扶正固本,清熱解毒散瘀之功。

在對加味四君子湯作用機制的進一步研究中我們發現其可影響Caspase-3、Caspase-7、Survivin的濃度變化,可上調宮頸癌模型大鼠Caspase-3、Caspase-7的濃度,抑制Survivin的表達。宮頸癌病情的進展與腫瘤細胞的過度增殖及凋亡減弱有關[6-10],誘導腫瘤細胞的凋亡是抗癌的主要方向,腫瘤細胞的凋亡減弱,導致機體原本細胞增殖/凋亡平衡受破壞,導致大量的腫瘤細胞無法正常凋亡而出現異常增殖,病情日久則腫瘤病灶日趨增大,并逐漸向其他組織或器官侵潤擴散,因此抑制腫瘤細胞的過度增殖,促進其凋亡是抗癌的靶向[11-14]。Caspase家族是介導腫瘤生長周期的重要因子,其中Caspase-3、Caspase-7是其關鍵成員,其濃度升高可促進腫瘤細胞的凋亡。Survivin[15-17]是目前公認的抑制細胞凋亡的因子,Survivin可通過激活因子酶原的活性而產生抑癌效應,有研究發現健康肌體Survivin幾乎無表達,而宮頸癌腫瘤組織中的Survivin呈現高表達狀態[18],因此有研究人員[19-20]認為Survivin可作為診斷及評估惡性腫瘤治療療效的獨立因子。在本研究中我們認為加用加味四君子湯的大鼠Caspase-3、Caspase-7表達上調,Survivin水平減弱,由此我們認為加味四君子湯可通過誘導促凋亡抑制的表達,從而實現抑制腫瘤細胞的凋亡,重新維護增殖與凋亡間的平衡,抑制腫塊的生長,縮小腫瘤組織體積。

由此,我們認為加味四君子湯有明顯的抗癌功效,可顯著縮小宮頸癌病灶體積,其作用機制可能是通過調節Caspase-3、Caspase-7、Survivin表達而實現促進腫瘤細胞凋亡有關,臨床建議推廣運用。