計算機輔助蒙藥治療薩病的作用機制

滿 達 木其爾 白明慧 馬十月 黃樹青 金薩出茹拉 特木其樂

(內蒙古自治區國際蒙醫醫院，呼和浩特，010065)

薩病是以突發昏厥、言語及肢體活動障礙為主要表現的蒙醫白脈疾病[1]。疾病在表現上與中醫“中風”相似，涵蓋現代醫學的腦梗死、腦出血等疾病。因其具有極高的致死和致殘率[2]，歷來受到醫家的高度重視。蒙醫藥歷史悠久[3]，經典文獻對薩病亦有諸多論述。珍寶丸、嘎日迪十三味丸等名方是目前蒙醫臨床治療該病的主要藥物[4]，應用上述2種藥物的臨床研究報道目前較為多見。但是，對其作用機制的研究報道較為少見，此外尚有眾多薩病方劑未見系統研究的報道。

基于此現狀，本研究對蒙醫經典文獻進行了回顧性分析。將篩選到的薩病方劑信息經數據挖掘、網絡分析后得到了這些方劑較為核心的特征，經專家討論，確定了核心配伍。進一步對核心配伍開展網絡藥理分析后，得到了蒙醫薩病藥物作用機制的預測結果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料來源 結合臨床與文獻，發現目前仍以古方珍寶丸、嘎日迪13味丸為主要藥物，尚無新的自擬方的方劑信息供查詢。所以，我們系統查閱了蒙醫臨床著作17部，包含了《秘訣方海》《甘露四部》等蒙醫經典著作。

1.2 納入標準 納入含有完整方劑信息的臨床著作；納入疾病名稱記載為“薩病”“嘎日格病”“嘎日格阿塔病”“怒羅病”“思古德日病”者。

1.3 排除標準 排除方劑信息不完整的著作；排除以經典注釋為內容的著作；排除重復記載的方劑；關聯分析時排除單味藥物組成的方劑。

1.4 數據規范 初篩共得到薩病方劑共133首，排除重復項及只含單味藥物的方劑，最后將114首方劑納入分析。方中涉及蒙藥192味。關聯分析時將方劑中常出現的“六良藥”(紅花、草果、天竺黃、白豆蔻、肉豆蔻、丁香)一并錄入為“六良藥”，最后將193味蒙藥納入分析。參照(2006年出版)教材《蒙藥學》對藥品名稱進行規范。

1.5 數據錄入 方劑以及網絡藥理研究過程中的成分、靶點、通路等需要整理錄入的信息，均由雙人錄入EXCEL 2007軟件，核對無誤后存為后續分析軟件方便讀取的CSV格式。

1.6 數據分析 應用R 3.4.3(https://www.r-project.org/)對薩病進行頻數、關聯分析及可視化；應用Gephi 0.9.2(https://gephi.org/)進行方劑復雜網絡分析、核心方藥物-成分-靶點網絡分析及可視化；應用Cytoscape 3.6.0(http://www.cytoscape.org/)進行靶點-通路網絡分析、蛋白質互作用網絡的分析及可視化。成分查找以及潛在靶點的評分、預測應用BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)進行。為求結果更加可靠，本次將評分標準設置為≥80分(平臺默認設置為≥20分)。從結果的“disease”欄中選取與蒙醫薩病有關的如Stroke、Brain ischemic insult、Ischemia reperfusion injuries等疾病的對應靶點。蛋白質互作分析平臺STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)用于所得靶點的互作用網絡數據獲取，同時，通過該平臺獲得薩病相關信號通路信息。

2 結果

2.1 藥物頻次統計 192味藥物當中出現頻次大于20次的前10味藥物為黑云香、麝香、白云香、訶子、石菖蒲、草烏、木香、硫磺、牛黃、決明子。見表1。

2.2 關聯規則挖掘 關聯規則分析使用R軟件的arules包來實現，并用arulesViz包實現可視化，規則挖掘的算法為Apriori算法。提取支持度(support)≥20、置信度(confidence)≥80的規則。所得規則提升度(lift)均>1。規則數據見表2，氣泡圖見圖1。

表1 薩病方劑使用頻次≥20次的藥物

表2 薩病方劑關聯規則(支持度≥20；置信度≥80)

圖1 薩病方劑關聯規則

2.3 復雜網絡分析 將方劑成分的鄰接表載入Gephi 0.9.2，計算節點度(degree)并模塊化(modularity)，全部藥物可分成6個模塊。節點度大于100的藥物排序為：麝香>石菖蒲>訶子>黑云香>白云香>紅花>草烏>木香>肉豆蔻>天竺黃>丁香>白豆蔻>牛黃。上述藥物分屬于模塊0、2、3。見圖2。分析網絡可見，模塊2中的重點藥物多為清熱、解毒、抑“赫依”藥物，如紅花、訶子、肉豆蔻等。模塊0包含黑云香、草烏、石菖蒲等藥物均為剎“粘”藥物，同時部分也有燥“黃水”功效。模塊3中主要為白云香、木香、決明子等具有燥“黃水”祛“巴達干”功效的藥物。

2.4 核心配伍的確定 結合上述分析以及前期其他相關分析以及專家討論意見，確定以麝香、黑云香、木香、訶子、石菖蒲5味藥組成的薩病核心配伍方(暫命名為Sildeg-5)[5]。該5味藥物當中除黑云香以外的4味藥是蒙醫經典方嘎日迪5味丸的4個組成藥物。前期研究發現嘎日迪5味丸在薩病方劑組方當中有非常重要的地位，多個方劑是由其為基礎方而組成的。其中包括現臨床使用最廣泛的嘎日迪13味丸。

圖2 薩病方劑復雜網絡

2.5 網絡藥理學分析

2.5.1 基于BATMAN-TCM的潛在作用靶點預測 將上述藥物以組合的方式錄入BATMAN-TCM的Example 2欄當中，并設置Score cutoff為80，Adjusted P-value設置為默認值0.05。運行后經篩選得到薩病相關靶點33個，將其錄入蛋白質互作用分析平臺STRING。運行后得到的網絡數據載入Cytoscape 3.6.0，互作用網絡圖見圖3、模塊化網絡(Gephi)圖見圖4。分析可見degree最高的節點為F2，其次還有AKT1、PTGS2等，且上述靶點均集中在模塊0當中。分析模塊化網絡，發現模塊0包含凝血酶原、外消旋α-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等10個蛋白質。它們通過參與細胞應對有機環狀化合物、應對含氧化合物、細胞發育、活性氧代謝過程的調節等，涉及細胞凋亡和增殖的調控過程。模塊5包含的多巴胺受體、5-羥色胺受體等可通過刺激神經受體-配體相互作用通路，參與陰離子轉運調控、胺的轉運調控等生物過程。模塊3主要參與激活G蛋白偶聯受體信號通路而引起的血管舒張、抑制血小板聚集、抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移等過程。模塊1中的纖溶酶原激活物(t-PA)、血栓調節蛋白、整合素β2則通過補體和凝血級聯反應途徑參與凝血過程的調節。

2.5.2 蛋白質富集通路分析 上述潛在靶點富集的通路共有28條，其中p值最小的通路當中有14個基因富集在KEGG pathway ID為has04080的神經活性配體-受體相互作用信號通路上。其次還有鈣離子信號通路、多巴胺能神經突觸、含血清素神經突觸等通路。見圖5、6。

圖3 Sildeg-5治療薩病靶點互作用網絡

圖4 Sildeg-5治療薩病靶點模塊化網絡

圖5 Sildeg-5治療薩病預測通路

2.5.3 藥物-成分-靶點網絡的構建 本方與靶點對應成分共有58個，將藥物成分及其預測靶點資料以鄰接表形式載入軟件，我們得到了Sildeg-5治療薩病成分-靶點及藥物-成分-靶點網絡。分析可見該網絡具有少數成分對應多個靶點、少數靶點對應多個成分的蒙藥多成分、多靶點特征。從網絡可見麝香藥物成分17β-雌二醇在藥物成分當中節點度最高、涉及靶點眾多，節點度為10。此外麝香成分數雖少于木香，但其預測作用靶點卻是方中最多的。而靶點當中雌激素受體、磷酸二酯酶3A、阿片受體、鹽皮質激素受體在網絡當中具有較為重要的地位，其節點度分別為17、15、11、9。見圖7-9。

圖6 Sildeg-5治療薩病靶點-通路網絡

圖7 Sildeg-5治療薩病成份-靶點網絡

3 討論

臨床中薩病仍以缺血性腦卒中為主，其次為出血性卒中。卒中后的神經損傷是一個多層次、多種途徑參與的復雜過程。既往單一靶點的干預并未得到令人滿意的治療效果，從而使得神經血管單元(Neurovascular Unit，NVU)的概念被提出[6]。蒙藥多組分、多靶點的作用機制恰好符合NVU的概念及其基于NVU的治療理念。

圖8 Sildeg-5治療薩病藥物-成份-靶點網絡

圖9 Sildeg-5治療薩病藥物成分-靶點數量對照

本方組成為蒙醫經典方嘎日迪5味丸當中的四味藥物-石菖蒲、麝香、木香、訶子另加黑云香共5味。石菖蒲即為蒙藥“烏木黑哲格蘇”，有助胃火、消食、開胃、止腐、殺粘、排黃水功效。現代研究發現其有效成分可能通過抑制細胞色素C和Caspase-3的激活[7]、抑制受損神經元細胞內鈣離子水平增高[8]、穩定細胞線粒體膜電位[9]、抑制BAX基因表達，增強BCl-XL基因表達等途徑對缺血再灌注損傷等神經損傷具有保護作用[10]。本方當中石菖蒲成分對應的潛在靶點有磷酸二酯酶3A(PDE3A)、電壓門控鉀通道亞家族成員5(KCNA5)、γ-氨基丁酸A型受體γ2亞基(GABRG2)、γ-氨基丁酸受體亞基a5(GABRA5)、雌激素受體(ESR1)、乙酰膽堿酯酶(ACHE)6個靶點。分析發現PDE3A不僅對應石菖蒲的成分，同時還受麝香、木香、黑云香成分的調控。PDEs能夠通過催化細胞內的cGMP和cAMP水解而影響生物體的代謝功能，包括與薩病有直接關聯的抑制血小板聚集過程。磷酸二酯酶抑制劑潘生丁、西洛他唑以及其受體拮抗劑噻氯吡啶、氯吡格雷均作為抗血小板聚集藥物而應用于卒中臨床[11-18]。民族藥方面也有相關研究報道，如譚萍等[19]研究發現銀杏葉提取物中槲皮素能抑制血小板PDE3活性，具有抗血小板聚集作用。

蛋白質互作用網絡當中與PDE3A關系最緊密的為AKT1，AKT1也是蛋白質網絡中的關鍵節點之一。AKT是一種處于P13K/Akt信號通路核心部位的絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有促進細胞增殖、生長、抑制細胞凋亡等作用，AKT1為其中一種亞型。近年來的一系列研究發現PI3K/Akt信號通路與腦缺血損傷有密切的關系[13，16]，中醫藥領域亦不乏相關研究[14-15，17-18]，但尚缺少蒙醫藥在這一方面的研究報道。本研究數據可見AKTI其對應的成分為22,23-二氫豆甾醇(β-谷甾醇)。β-谷甾醇廣泛存在與多種植物當中，因其具有抗癌、抗炎、抗氧化、降血脂、抑制血小板聚集等多種作用而受到關注[20-21]。此外β-谷甾醇尚具有植物雌激素樣作用，其作為弱激動劑，可作用于雌激素受體(ESR)，而ESR又與腦損傷的神經保護密切相關[22]。

本方當中β-谷甾醇來源于蒙藥木香。木香的蒙藥名稱為“如達”，蒙醫認為如達具有祛巴達干、調和氣血、調和體素、止痛等功效。方中其成分最多且對應的靶點也僅次于麝香，當中不僅有前述關鍵靶點AKT、PDE,還有腦缺血損傷后神經保護相關蛋白NR3C2、GRIN2B、ESR1等。研究發現鹽皮質激素(NR3C2)除在腎臟表達外還在人的大腦中有高表達。其受體拮抗劑可通過防止內皮功能紊亂、氧化應激以及血管重塑等途徑而可能對腦卒中有干預作用[23]。GRIN2B是配體門控離子通道-N-甲基-D-天冬氨酸(NMDAR)中的主要功能亞單位。神經元細胞在持續缺血缺氧情況下釋放谷氨酸等興奮性氨基酸，通過對細胞膜上的NMDA通道的激活，進而介導Ca2+大量內流，形成細胞內鈣超載，導致神經元死亡，也就是所謂的“興奮性毒性”。根據NMDR受體亞型學說，GRIN2A負責激動神經細胞的成活信號系統，而GRIN2B則負責激活死亡信號系統[24]。不過，GRIN2B的激活還只是這一信號系統的啟動階段，此后還有諸多下游信號蛋白參與細胞的死亡過程，包括本方靶點之一的一氧化氮合酶(NOS)[25]。

如前所述，雌激素受體(ESR1/2)參與介導17β雌二醇等雌激素對中樞神經系統的保護作用，其機制可能有拮抗NMDA受體介導興奮性氨基酸毒性作用、抗氧化應激、抗炎、抑制β-淀粉樣蛋白沉積等[26]。回顧預測數據可見雌激素受體可受方中多種成分調節，其中目前已明確的對應成分(Known Target in DrugBank,KEGG,TTD)為來自麝香的17β雌二醇。麝香是一種名貴藥材，蒙醫認為其有殺粘、燥黃水、解毒、開竅之功效，是薩病方劑網絡當中degree最高的藥物。本次預測研究過程中，麝香貢獻了14個成分、涉及25個靶點，其中17β雌二醇的degree最高。除上述機制以外，17β雌二醇可能的神經保護途徑還與抑制DKK-1的表達和激活Wnt/β-catenin信號通路有關[27]。

此外，訶子、黑云香在蒙醫方劑當中是應用較為廣泛的藥物。訶子，蒙醫謂其“藥中之王”，有祛“邪病”、解毒、調三根、止瀉功效。研究發現，訶子具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌等藥理作用[28]。本研究發現訶子成分Linoleic Acid(亞油酸)對應靶點前列腺素內過氧化物酶2(PTGS2)的評分高達686分。已知PTGS2可引起炎性反應并介導炎性細胞毒性，急性腦缺血事件中，PTGS2可從神經元、血管、血腦屏障幾個層面參與中樞神經損傷[29]。另外訶子的靶點也包括與腦缺血損傷密切相關的胺類受體5-羥色胺受體(HTR2A、HTR1A)和多巴胺受體(DRD2、DRD3)。HTR、DRD也作為神經活性配體-受體互作用通路上的重要蛋白質而成為多種藥物的靶點。研究發現多巴胺受體參與卒中后穩定血腦屏障的過程[30]，DRD2激動劑則具有廣泛的抗凋亡性質[31]、參與神經再生和血管新生作用[32]。黑云香(目前制劑應用沒藥)是薩病方及網絡當中節點度僅次于麝香的藥物。黑云香具有殺粘、鎮刺痛、消腫等功效。蒙醫薩病急性期尤其昏迷患者可應用黑云香鼻熏治療，方劑分析還發現其他薩病的鼻熏劑當中，黑云香也與石菖蒲配伍而作為核心藥物來應用。本次其預測靶點有阿片受體、t-PA、γ-氨基丁酸受體、血管緊張素Ⅱ受體等。其中成分Cinnamaldehyde(肉桂醛)與阿片受體結合的評分高達373分、Eugenol(丁香酚)與阿片受體結合的評分114分，這一結果與黑云香鎮痛作用高度吻合，也側面說明本次預測研究的可靠性。前期尚未見黑云香在薩病治療當中單獨或入方應用時其作用機制方面的報道，本研究得到的潛在靶點可為進一步研究其作用機理提供一定參考。黑云香靶點當中t-PA(t-PA)存在于神經血管單元的微小血管和星形膠質細胞、少突觸膠質細胞、小膠質細胞和神經元當中[33]，t-PA除溶栓作用外,還能在病理狀態下通過激活MMPs以及其他信號通路釋放其神經毒性作用,損傷血腦屏障(BBB)加重NVU的損傷[34-35]。

本研究初步預測Sildeg-5可能從神經血管單元的各個層面干預薩病病理過程。其通過多成分、多靶點以及多條通路干預薩病治療的機理仍有待于進一步挖掘研究并要通過實驗過程來驗證。