氣相色譜-質譜研究加味逍遙丸中的揮發性成分

陳 波 烏日根

(內蒙古醫科大學附屬醫院藥劑部,呼和浩特,010000)

加味逍遙丸又名丹梔逍遙丸,出自《太平惠民和劑局方》,是在逍遙丸的基礎上加牡丹皮、梔子二味而成。是疏肝解郁,清熱調經的常用方劑,由此制成的中成藥因療效切確、使用簡便從而在臨床上得到廣泛的使用[1]。因加味逍遙丸龐大的市場基礎,故生產廠家眾多。由于復方的中成藥制劑中,其各個藥味間相互配伍,藥性及藥物有效化學成分的相互作用機制都較為復雜,故不同的生產企業和藥品批次之間,其藥物的有效成分及產品質量存在一定的差異[2-3]。故而對中成藥的復方進行研究,以求明確各個藥物的有效成分及相互的藥理作用,對提高制備后中成藥質量控制及臨床療效有重要的意義,因此這也成為近年來中藥研究的熱點。目前在加味逍遙丸的藥物研究中,多為使用薄層色譜法、高效液相色譜法等進行藥物的有效成分及含量的鑒定[4-7],而這些檢測方法,常常不能對加味逍遙丸中會發性成分加以檢測及定性鑒別。而在組成加味逍遙丸的多種中藥均含有揮發性的藥物成分,例如當歸、梔子、丹參、柴胡、白術、芍藥、薄荷、生姜中均含有揮發性的藥物成分,而這些成分也是加味逍遙丸的有效藥物組成,忽視這些揮發性藥物的研究,則對成藥組方的藥理、藥效和質量評價等方面的研究均是不夠客觀或較為片面的,這將不利于中成藥制作工藝和質量控制體系的提升。氣相色譜-質譜分析(Gas Chromatography-mass Spectrometry,GC-MS),是一種將氣相色譜(Gas Chromatography,GC)[8]和質譜分析(Mass Spectrometry,MS)[9]聯合應用的技術。它可直接使用GC分離樣品,并使分離后的化合物通過MS進行離子化,同時具有GC的高效分離和MS的準確定量的有點,故而目前已經成為研究揮發性化合物的最為有效及普遍的方法之一。本研究使用GC-MS對加味逍遙丸中揮發性成分進行分離及鑒定,旨在更為全面、客觀的了解加味逍遙丸中各種揮發性有效成分的組成和藥效,提供有效的鑒定方法,以期為逍遙丸的氣相色譜指紋圖譜及藥物質量管理提供客觀依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 揮發油提取器(型號:DGT,供應商:天津市德固特科技發展有限公司);氣相色譜-質譜聯用儀(型號:GCMS-QP2010,供應商:日本島津公司);氣相色譜-電子捕獲檢測器(型號6890N;供應商:美國Agilent公司)。

1.2 試劑 正己烷和正十八烷均購于北京中科儀友化工技術研究院;實驗用二次蒸餾水。

1.3 分析樣品 加味逍遙丸(北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠,國藥準字Z11020248)。

2 方法與結果

2.1 GC-MS色譜質譜條件 色譜條件:選擇直徑為0.25 μm的Rxi-5ms的色譜柱(規格:30 m×0.25 mm),柱流量為1 mL/min;以氦氣(He)為載氣,采用30∶ 1的分流比;進樣量:0.5 μL,以260 ℃為進樣口溫度,升溫程序:首先保持初始柱溫60 ℃ 3 min,隨后以10 ℃/min的升溫速率升至175 ℃,再下降10倍升溫速率以1 ℃/min緩慢升溫至195 ℃,最后增加5倍升溫速率以5 ℃/min升溫至240 ℃,維持15 min后再緩慢升至250 ℃的接口溫度;溶劑延遲時間為3 min。質譜條件:電子轟擊離子源的轟擊能量設置為70 eV,離子源溫度設置為200 ℃;以0.7 KV為檢測電壓;采用全譜掃描,其質量掃描范圍為m/z 40～550 amu,質譜數據庫參照NIST庫。

2.2 內標溶液的制備 采用容量瓶精密量取100 μL正十八烷作為內標物,以10 mL正己烷定容,配制出濃度為7.8 mg/mL的內標溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取18 g加味逍遙丸樣品粉碎物,倒入500 mL圓底燒瓶中,為充分使加味逍遙丸樣品碎裂細小化,在圓底燒瓶中加入270 mL二次蒸餾水并室溫浸泡10 h;加味逍遙丸揮發性成分提取參照《中華人民共和國藥典》[10]附錄XD“揮發油測定法”甲法的實驗規定,加熱圓底燒瓶使樣品溶液微微沸騰,并保持水蒸餾微沸狀態11 h,采用揮發油提取器收集揮發性成分;加入適量無水硫酸鈉到蒸餾所得到的揮發性成分中幫助其干燥除水,將干燥后的揮發性成分小心移取至1.5 mL樣品瓶中,加入精密量取的7.8 mg/mL正十八烷內標溶液100 μL,并以正己烷定容至1.5 mL,充分混合均勻既得供試品溶液,4 ℃下密封保存待用。

2.4 正交實驗設計 根據提取時間、固液比和浸泡時間這3個重要實驗因素進行正交實驗設計,結果顯示,將提取時間9 h、固液比1∶ 15、浸泡時間10 h時是水蒸餾法提取加味逍遙丸中揮發性成分的最佳提取條件。

2.5 專屬性試驗 取同一供試品溶液根據2.3制備的供試品溶液各5 μL,加味逍遙丸專屬性試驗采用薄層層析方法(TLC)進行操作,將供試品溶液分別點于同一片硅膠G薄層色譜板,以環乙烷和乙酸乙酯作為展開劑,配比為19∶ 1;晾干后隨即將40%硫酸溶液(含有2%對二甲氨基苯甲醛)噴在色譜板上,加熱至100 ℃,冷卻5 min后在紫外光燈(波長365 nm)下觀察,專屬性試驗結果顯示加味逍遙丸的專屬性良好。

2.6 精密度試驗 提取1份按照2.3項下GC-MS分析條件制備的加味逍遙丸樣品溶液,連續測定6次,以內標物正十八烷的相對保留時間和相對峰面積作為參照,計算得到各主要峰的相對保留時間和相對峰面積,結果顯示相對保留時間(Tr=Ti/Ts)的RSD(n=6)為0.0074%～0.24%,相對峰面積(Ar=Ai/As)的RSD(n=6)為0.41%～4.7%,均符合RSD小于5%的要求,表明氣相色譜精密度良好。

2.7 穩定性試驗 提取1份按照2.3項下GC-MS分析條件制備的加味逍遙丸樣品溶液,分別在8個不同時間段內(0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h)進行檢測,以內標物正十八烷的相對保留時間和相對峰面積作為參照,計算得到各主要峰的相對保留時間和相對峰面積,結果顯示相對保留時間(Tr=Ti/Ts)的RSD(n=8)為0.0065%～0.32%,相對峰面積(Ar=Ai/As)的RSD(n=8)為0.33%～4.9%,均符合RSD小于5%的要求,說明了加味逍遙丸樣品溶液在48 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗 提取6份按照2.3項下GC-MS分析條件制備的同一批次加味逍遙丸樣品溶液,以內標物正十八烷的相對保留時間和相對峰面積作為參照,計算得到各主要峰的相對保留時間和相對峰面積,結果顯示相對保留時間(Tr=Ti/Ts)的RSD(n=6)為0.018%～0.51%,相對峰面積(Ar=Ai/As)的RSD(n=6)為0.19%～4.8%,均符合RSD小于5%的要求,證明了GC-MS試驗重復性良好。

2.9 樣品測定結果

2.9.1 加味逍遙丸揮發性成分總離子流色譜圖 加味逍遙丸在氣相色譜-質譜研究中以正十八烷(S)為內標物,檢測到53中揮發性成分。見圖1。

2.9.2 加味逍遙丸揮發性成分分析 將總離子流色譜圖中所檢測出的色譜峰與NIST標準質譜數據庫中的標準譜圖進行參照比較,分析53個揮發性成分的具體化學成分信息,其中芳香族類和萜烯類揮發性成分均有11種,萜醇類揮發性成分有8中種,醛類揮發性成分有6種。見表1。

3 討論

氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)是一種氣相色譜和質譜檢測聯合使用的檢測技術,自從1957年被開發以來,GC-MS技術已經成為目前應用最廣泛的檢測手段。幾乎在所有的中藥檢測分析中,特別是如中成藥等復雜的混合物檢測,GC-MS已經成為主要的藥品定性、定量檢測最為有效的方法之一[11]。例如,陳智煌等[12]使用GC-MS法對羌活的揮發油成分進行分析,并確定其相關成分的特征指紋圖譜,總結了羌活揮發油具有抗炎、鎮痛作用的主要藥理成分。薛子鈺等[13]則使用GC-MS對不同炮制方法的當歸進行觀察,分析了當歸揮發油的成分及對大鼠尿液代謝可能起到作用的相關機制。本研究在使用GC-MS對加味逍遙丸的揮發性成分進行研究,可較為全面的、綜合的反應出不同揮發性成分間的差異。

圖1 加味逍遙丸揮發性成分總離子流色譜圖

注：S為內標物正十八烷

表1 加味逍遙丸揮發性成分分析

3.1 內標溶液的制備 使用正構烷烴作為內標的參照物進行GC分析。在分別使用正已烷、正十二烷、正十四烷、正十六烷、正十八烷等進行連續測樣3次后,正十二烷、正十四烷的色譜峰位間相互距離較大,而正十六烷峰位與樣品重疊,不利于樣品揮發性的成分檢測,均不作為內標參照物,故在篩選后選用正十八烷作為內標,正已烷定容,制備出對檢驗樣品無干擾的內標溶液。

3.2 揮發性成分的提取 揮發性成分多存在于植物的花、根、葉、根莖、果實和種子中,多為萜類、芳香族類、脂肪族類和含氮含硫化合物等,其中萜類及其含氧衍生物在揮發油中具有較高的含量,芳香族化合物通常具有生物活性,是揮發油特異芳香氣味的來源[14];本研究結果與上述描述一致,結果顯示,總離子流色譜圖中分析53個揮發性成分的具體化學成分信息,其中芳香族類和萜烯類揮發性成分均有11種。揮發性成分的提取分離技術,決定了后續質量研究的品質。目前揮發性成分的提取方法有很多,如水蒸餾法、超聲提取技術等[15],在加味逍遙丸揮發性成分研究的提取中常用的水蒸餾提取法和超聲技術提取法[16],其中水蒸餾法是《中華人民共和國藥典》推薦的標準方法;而超聲提取法是通過機械效應和熱效應,平衡提取溶劑并提高揮發性成分的溶解度。有研究人員在采用水蒸餾法和超臨界CO2流體萃取法提取逍遙散揮發性成分的研究中,水蒸餾法提取所得的揮發性成分較超臨界CO2流體萃取法提取所得的揮發性成分復雜,因此本研究采用水蒸餾法提取加味逍遙丸中的揮發性成分。

3.3 正交實驗設計 在稱取18 g加味逍遙丸后,將其粉碎,碎后的顆粒放置于500 mL圓底燒瓶中,加入一定量的蒸餾水后,分別選擇不同提取時間(4 h、6 h、8 h、9 h、10 h)、藥品與蒸餾水的不同固液比(1∶ 5、1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20)、不同浸泡時間(2 h、6 h、10 h、14 h、18 h)作為干預條件,觀察不同條件下對相對峰面積的影響。在分別進行多次不同的平行試驗后,我們可確定,在選擇加味逍遙丸顆粒與蒸餾水固液比為1∶ 15、浸泡10 h,提取時間為9 h時,其相對峰面積為最大,表明其為最佳實驗條件,故選擇此作為正交實驗條件[17-18]。

3.4 色譜柱的選擇 在GC-MS分析法中,選擇正確的毛細管柱,對結果的精密性、準確性、穩定性及可重復性的影響至關重要。在分別比較agilent CP-SIL5CB、CP-SIL13CB、CP-SIL24CB、HP-1、HP-5等毛細管柱后,發現HP-5(30 m×0.32 mm,0.25 μm)具有較好的分離度,柱效和所獲得的色譜峰數較好。