復方魚腥草膠囊中連翹苷和黃芩苷的高效液相色譜法含量檢測

周寶玉 虞文妹

(南京中醫藥大學附屬常州市武進中醫醫院中藥房，南京，213161)

復方魚腥草膠囊是近年來《中華人民共和國藥典》新增加的中藥復方制劑，臨床生產和使用量較大，有多家廠家獲得復方魚腥草膠囊的生產批準文號，復方魚腥草膠囊的主要藥物組成及比例為魚腥20：草板藍根5：黃芩5：連翹2：金銀花2，該方主要用于治療具有風熱證候表現，因外感風熱而起咽喉疼痛、急性扁桃體炎、急性咽炎等病癥，全方以魚腥草為君藥清熱解毒，以黃芩、板藍根為臣藥，清熱瀉火、燥濕涼血、解毒利咽，以連翹和金銀花為佐使，助君臣清散風熱，涼血解毒之功[1-2]。目前關于復方魚腥草膠囊的文獻報道較少，有研究顯示高效液相色譜法(HPLC)分析發現魚腥草中藥理活性較多[3-4]，有研究復方魚腥草合劑中薄層色譜法(TLC)研究金銀花的主要成分綠原酸并測定其含量[5]，然對該方中主要藥物的連翹和黃芩，目前的報道研究較少，基于此，本課題組以測定連翹苷和黃芩苷為主要研究指標，檢測復方魚腥草膠囊中二者的含量，以滿足患者不同服藥需求，現將復方魚腥草膠囊HPLC研究詳細報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 沃特世高效液相色譜儀2695，沃譜達儀器(蘇州)有限公司);外校電子精密天平(梅特勒ML802，蘇上海精學科學儀器有限公司);TQC薄層板涂布器(VF2161，上海諾彩貿易有限公司)

1.2 試劑 色譜HPLC甲醇，色譜HPLC冰醋酸、色譜HPLC乙腈、色譜HPLC磷酸和色譜HPLC無水乙醇均購于上海展云化工有限公司;中國食品藥品檢定研究院提供的超純水、連翹苷對照品(批號-110821-201514)和黃芩苷對照品(批號-0715-9909)。

1.3 分析樣品 隨機選取2個不同廠家生產的樣品1：復方魚腥草膠囊(云南云龍制藥股份有限公司，國藥準字Z20055662)；樣品2：復方魚腥草膠囊(安徽威爾曼制藥，國藥準字Z20050708)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用ACQUITY-BEHP-henyl-C18保護柱(5 μm)，以室內溫度為柱溫，進樣量為20 μL以乙腈為流動相A，以水+0.02%磷酸為流動相B，流速1.0 mL/min：檢測波長為327 nm。

2.2 對照品溶液的制備 首先將連翹苷對照品、黃芩苷對照品放置于60 ℃真空干燥至恒重，然后分別精密稱取10.3、5.3 mg于50 mL量瓶中，連翹苷對照品瓶加入50%甲醇適量，黃芩苷對照品瓶加入無水乙醇適量，均超聲溶解，混合均勻后制成連翹苷對照品溶液(0.206 mg/mL)和黃芩苷對照品溶液(含黃芩苷0.106 mg/mL)。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取復方魚腥草膠囊的內容物3.0 g于20 mL的錐形瓶中并加入適量甲醇，采用軟木塞塞緊瓶口，充分混合均勻后記錄重量，超聲處理(功率500 W)30 min后，待溶液冷區后記錄重量，比較2次重量，計算重量差并以甲醇補齊至等重，采用0.45 μm微孔濾膜過濾混合液制成供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 取同一供試品溶液根據2.3制備的供試品溶液，采用HPLC對復方魚腥草膠囊中連翹、黃芩等進行專屬性試驗，結果顯示如圖1和圖2，復方魚腥草膠囊中連翹和黃芩專屬性良好。

圖1 連翹專屬性試驗HPLC色譜圖

圖2 黃芩專屬性試驗HPLC色譜圖

2.5 線性關系考察 分別精密量取連翹苷、黃芩苷對照品的甲醇溶液3.0、6.0、12.0、18.0、24.0 mL，分別置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻后分別精密吸取10 μL，采用HPLC，記錄峰面積；以對照品進樣量(μ g)為橫坐標(X，峰面積積分值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，連翹苷回歸方程Y=98 009X-86650，r=0.999 2(n=5)，結果表明，連翹苷對照品在3.23～103.02 μg/mL范圍內線性關系良好；黃芩苷回歸方程Y=212 284X+108 806，r=0.999 8(n=5)，結果表明，黃芩苷對照品在2.74～87.89 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.6 中間精密度試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，連續進樣5次，結果顯示相對標注偏差RSD是1.13%，精度度良好。

2.7 供試品溶液穩定性試驗 在室溫下精密吸取10 μL同一供試品溶液，配置后分別放置0、1、4、8、10、12、24 h后進樣檢測，結果顯示24 h內供試品溶液基本穩定，RSD是1.35%。

2.8 重復性試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，在相同色譜條件，相同液相分析儀上檢測5次，結果顯示標準偏差RSD為1.20%，重復性良好。

2.9 回收率試驗 采用加樣回收法，精密稱取5份已知含量的同一批號樣品各約0.5 g，分別精密加入20 mL混合對照品甲醇溶液(0.005 36 mg/mL)，進行回收率試驗測定，計算結果顯示平均回收率為99.07%，RSD為0.75%。見表1和表2。

表1 連翹苷回收率試驗測定結果

表2 黃芩苷回收率試驗測定結果

2.10 樣品測定結果

2.10.1 薄層色譜法鑒別連翹苷和黃芩苷 將制成的對照品和供試品溶液分別吸取5 μL滴于硅膠G薄層板上，在展開劑23醋酸丁酯:8甲酸:7水的作用下，經365 nm的紫外燈觀察發現連翹苷和黃芩苷在陰性對照品位置上相互之間不存在干擾現象。見圖3。

圖3 復方魚腥草膠囊中連翹苷和黃芩苷的鑒別

注：1.金銀花、魚腥草雙陰性對照品，2.黃芩陰性對照品，3～5復方魚腥草膠囊，6.連翹苷，7.黃芩苷

2.10.2 高效液相色譜分析連翹苷和黃芩苷含量 在每批樣品做3次重復研究取平均值后，結果顯示2個樣品中連翹苷和黃芩苷的含量和RSD值均差不多，具體數值如表3所示。

表3 復方魚腥草膠囊中連翹苷和黃芩苷含量測定結果

3 討論

3.1 流動相的優化 在分離連翹藥材中的連翹苷和黃芩藥材中的黃芩苷的HPLC研究中，實驗室流動相優化研究中，分別以水-甲醇、水-乙腈，乙腈-0.01%磷酸，乙腈-0.02%磷酸，乙腈-0.03%磷酸等不同的流動相進行分離，經過反復數次的研究后，發現室內溫度為柱溫，進樣量為20 μL時，以乙腈為流動相A，以水+0.02%磷酸為流動相B，流速1.0 mL/min：連翹苷和黃芩苷的分離度最大，能夠滿足后續研究中連翹苷和黃芩苷的定量測定，由此本研究最終選擇的流動相是乙腈-0.02%磷酸。

3.2 專屬性試驗的重要性 本研究復方魚腥草膠囊由五味藥組成，制訂了HPLC色譜法鑒別研究其專屬性進行定性質量評價；本研究的目的是檢查復方魚腥草膠囊中連翹苷和黃芩苷的含量，而復方魚腥草膠囊藥味多，藥性復雜，在有其他成分存在的可能情況下，如果連翹苷和黃芩苷這2個需要檢測的成分不具有專屬性，那么在后續的含量檢測中則可能因為雜質的影響而造成偏差。假如在專屬性試驗中發現含有雜質，那么在雜質可獲得的情況下，可以采用加入雜質到待測樣品于未加入雜志的待測樣品進行比較，考察雜質對目標成分含量測定是否存在干擾性[6-8]。基于前期研究條件如精密度、重復性、穩定性、線性考察和樣品回收率等方法的反復試驗調整了最佳HPLC色譜條件，顯示多元指紋圖譜是一種方法簡便，且具有高靈敏度、高重復性和較強的專屬性強的一種研究方法[9-12]；本研究結果HPLC色譜圖顯示復方魚腥草膠囊中連翹苷和黃芩苷的專屬性良好。

3.3 薄層色譜法與HPLC結合進行復方魚腥草膠囊含量檢測的意義 薄層色譜法(TLC)以涂布于硅膠板、玻璃板等支持劑上作為固定相并形成一個均勻的薄層，加入合適的展開劑作為其流動相，對樣品具有分離、鑒別和定量的功能[13-17]，由于TLC對生物高分子的分離效果不夠理想[18-19]，因此在定量性研究中，目前的主流研究方法是采用HPLC進行[20-21]，本研究采用TLC與HPLC 2種方法相結合的方式，對復方魚腥草膠囊中連翹苷和黃芩苷進行含量檢測。復方魚腥草膠囊的清熱解毒功效好，它是植根于深厚的中醫藥傳統理論基礎，同時結合豐富的臨床實踐經驗而被研發出來的中藥復方制劑，在當今存在“抗生素類藥物濫用”的情況下，《中華人民共和國藥典》收錄復方魚腥草膠囊的這一舉措，關注及肯定復方魚腥草膠囊在臨床的廣泛適用性和部分替代抗生素的治療價值的。研究中為控制復方魚腥草膠囊的藥物質量的安全性，在對連翹苷和黃芩苷含量檢測之前，首先采用薄層色譜法結合處方藥味所含化學成分及藥理學活性，對連翹中的連翹苷、黃芩中的黃芩苷等進行了定性鑒別，研究結果顯示3批不同的測試樣本的色譜斑點清晰，重現性好，空白均無出現干擾；接著應用多元指紋圖譜分析測定了復方魚腥草膠囊制劑中連翹苷、黃芩苷的含量，本研究結果顯示樣品1連翹苷含量0.51 mg，RSD為1.72%，黃芩苷含量14.6 mg，RSD為4.95%；而樣品2連翹苷0.50 mg，RSD為1.69%，黃芩苷含量14.3 mg，RSD為4.92%；2組復方魚腥草膠囊樣品中連翹苷和黃芩苷的含量差異無統計學意義。