芫花中抗腫瘤活性成分瑞香烷型二萜的含量測定研究

陳少茹 張誠光 陳雪婷,2 詹利之

(1 廣東省第二中醫院/廣東省中醫藥工程技術研究院,廣州,510095; 2 廣東省中醫藥研究開發重點實驗室,廣州,510095; 3 廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所,廣州,510405)

芫花(DaphnegenkwaSieb.etZucc)為瑞香科(Thymelaeaceae)瑞香屬(DaphneL.)植物,又名杜芫,老鼠花,棉花條,頭痛花,藥魚草(河北),黃陽花(陜西),野丁香花(山東),山麻皮(浙江)[1]。芫花功能與主治為瀉水逐飲,解毒殺蟲,用于水腫脹滿,胸腹積水,痰飲積聚,氣逆喘咳,二便不利,外治疥癬禿瘡,凍瘡[2-3],富含二萜類化合物,主要為瑞香烷型二萜,同時富含黃酮及雙黃酮類化合物,還有香豆素類、木脂素類,綠原酸類等多種化學成分。芫花的主要活性成分具有利尿瀉下和抗生育作用[4-5],其中抗腫瘤作用為目前研究芫花的熱點,而瑞香烷型二萜正是發揮其抗腫瘤作用的主要物質基礎[6-8]。現在關于瑞香烷型二萜的報道,多集中于分離和抗腫瘤活性研究,在質量控制方面的研究較為薄弱,缺乏系統評價質量的成分研究。

本實驗對芫花中主要的活性成分瑞香烷型二萜:yuanhuadine(1),yuanhuafine(2),genkwadaphnine(3)，yuanhuacine(2),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)進行含量測定研究,建立有效的HPLC方法,同時測定7個具有抗腫瘤活性的二萜,并對采摘自6個不同地區的芫花中的7個二萜進行含量測定分析,為以后芫花中瑞香烷型二萜的質量控制提供參考依據。分子式見圖1。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Gilent 1200型高效液相色譜儀(四元泵、ALS、TCC、VWD和Chemstation工作站),色譜柱:ZorbaxEelipse SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),SartoiuSCP-225D型電子分析天平(Sartoius有限公司),BUCHI旋轉蒸發儀(瑞士),金利牌超生波清洗器(浙江象山縣石浦海天電子儀器廠),ALC-1100型電子分析天平(北京Sartoius科學儀器有限公司)。

圖1 芫花中7個瑞香烷型二萜

1.2 試劑 Yuanhuacine(2)對照品,批號ASD-00032031,純度95.7%,購自上海邁瑞爾化學技術有限公司,yuanhuadine(1),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7),對照品(1,3-7)為實驗室通過對芫花分離得到,其純度分別為94.2%(1),98.1%(3),92.9%(4),94.1%(5),93.7%(6),93.9%(7),無水乙醇、磷酸均為分析純,甲醇、乙腈為色譜純(山東禹王實業有限公司禹城化工廠)。

1.3 分析樣品 采集6批芫花藥材(河北、山西、陜西、甘肅、山東、江蘇),經廣州中醫藥大學中藥學院中藥鑒定教研室李小翠副教授鑒定為瑞香科瑞香屬芫花Daphnegenkwa。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:ZorbaxEelipse SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相:乙睛-0.1%冰醋酸水,檢測波長230 nm,進樣量10 μL,流速0.8 mL/min,柱溫40 ℃,采用二元梯度洗脫系統,溶劑A(乙睛),B(水、0.1%冰醋酸)梯度洗脫。見表1。

表1 流動相梯度

2.2 對照品溶液的制備 將對照品加適量甲醇溶解,并稀釋成濃度為0.632 1,5.022,12,33,24.66,80.1 mg/mL,混合放置于4 ℃冰箱冷藏保存備用。參照物的選擇:Yuanhuacine(2)為芫花的主要有效成分之一,且Yuanhuacine(2)與其他成分的色譜峰分離度較好,因此選擇Yuanhuacine(2)為參照物。

2.3 供試品溶液的制備 將粉碎的芫花過四號篩混勻,精密稱取芫花粉末0.25 g,放置于帶塞的錐形瓶中,精密加入75%乙醇30 mL并稱定重量,超聲處理60 min后再稱定重量,用75%乙醇補足減失的重量,濾過并取續濾液約6 mL,過C18固相萃取小柱,棄去約2 mL濾液,其余濾液用0.45 μm的濾膜濾過即得。

2.4 提取溶劑的篩選 提取溶劑的選擇:采用超聲提取法,分別用水、90%乙醇、75%乙醇、50%乙醇和同樣濃度的甲醇進行提取,結果75%甲醇和75%乙醇在上述色譜條件下,進樣檢測并記錄色譜圖,所含峰數較多,分離度良好,而且75%甲醇和75%乙醇提取的效率無明顯差異,考慮到甲醇具有毒性,因此選用75%乙醇作為芫花的提取溶劑。

2.5 線性關系考察 取“2.4”項下各對照品儲備液適量,以甲醇依次稀釋成系列對照品溶液,分別吸取10 μL注入Gilent 1200型高效液相色譜儀進行檢測,以各成分峰面積與對照品的進樣量(μg)進行線性回歸,得到各對照品的回歸方程和線性范圍,具體見表2。

2.6 中間精密度試驗 取同一供試品溶液(河北采集樣品)10 μL,連續進樣5次,結果yuanhuadine(1),Yuanhuacine(2),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)峰面積的RSD分別為2.51%、3.84%、2.77%、2.12%、3.31%,1.35%和3.14%表明本法日內精密度良好;取同一供試品溶液連續3 d每天進樣3次,結果yuanhuadine(1),Yuanhuacine(2),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)峰面積的RSD分別為2.65%、3.91%、4.11%、2.57%、1.78%、4.07%和2.46%,表明本法日間精密度良好。

2.7 供試品溶液穩定性試驗 取供試品溶液,分別于24 h、12 h、8 h、4 h、2 h和0 h進樣10 μL進行檢測,yuanhuadine(1),Yuanhuacine(2),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)峰面積的RSD分別為3.11%、2.58%、2.19%、2.14%、2.81%、3.45%和2.11%,結果顯示供試品溶液在制備后24 h內保持穩定。

2.8 重復性試驗 取芫花樣品(河北采集樣品)5份,精密稱定并按“2.4”項下方法制備供試品溶液,按“2.2”項下條件進樣檢測,結果測得yuanhuadine(1),Yuanhuacine(2),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)的平均含量分別為4.64、8.16、23.94、12.44、4.12、9.12和2.14 mg/g,RSD分別為0.5%、0.7%、0.6%、2.2%和0.5%,表明該方法重復性良好。

2.9 回收率試驗 精密稱取已知含量的芫花樣品(河北采集樣品)5份,每份0.25 g,精密加入各自對照溶液適量,按“2.4”項下方法制備供試溶液,按“2.2”項下條件進樣測定并計算加樣回收率,結果見表2。

2.10 樣品測定結果 取6批不同產地的芫花樣品,按“2.4”項下方法制備供試品溶液,精密吸取10 μL進樣測定,采用外標法計算芫花樣品含量,具體結果見表3,色譜圖見圖2。

表2 7個二萜的線性、精密度、重復性和穩定性考察(n=5)

表3 不同產地芫花中7個瑞香烷型二萜的含量差異

圖2 中藥芫花瑞香烷型二萜的HPLC圖譜

注：1 yuanhuadine(1),2 Yuanhuacine(2),3 genkwadaphnine(3),4 yuanhuacine(4),5 yuanhuahine(5),6 yuanhualine(6),7 isoyuanhuadine(7)

3 討論

本人在做全波長掃描,考察不同吸收波長的圖譜時,重點考察了210 μm、230 μm、254 μm、280 μm和360 μm處的圖譜特征。在230 μm處各成分具有較好的紫外吸收,基線平穩,分離度較好。因此,選擇230 μm為芫花中抗腫瘤成分瑞香烷型二萜的檢測波長。有研究顯示揮發性成分多存在于職務的根、莖、葉中,多數為萜類、芳香族類,其中萜類及其衍生物含有濃度較高的揮發油,查閱大量文獻[9-13]我們發現目前關于萜類及其衍生物的提取方法多樣,有蒸餾法、超聲提純法、醇提法等,在流動相的選擇方面,本人分別選了甲醇-水、甲醇-冰醋酸水作為流動相進行檢測,結果發現分離效果不理想,在采用乙睛-水進行檢測時,分離效果進一步提高,再嘗試加入冰醋酸改善分離效果,結果發現有更好的分離效果,故選擇乙睛-0.1%冰醋酸水作為檢測芫花的流動相。

從測定結果來看,7個瑞香烷型二萜的含量均很大,而且文獻報道這7個測試化合物均具有較好的抗腫瘤活性,說明我們測定的7個化合物具備較強的代表性;從6個不同產地的芫花藥材測定結果來看,7個二萜均可以被檢測到,且化合物genkwadaphnine(3)在6個產地的含量均較高,可以為以后深入研究芫花的質量控制提供參考依據;從總含量上看,來自甘肅的芫花藥材中7個瑞香烷型二萜含量明顯高于其他產地,提示二萜的含量可能和地域有關,并且我們還可以看到在地處平原氣候的地區如:河北、山西、陜西、山東產地的藥材中瑞香烷型二萜含量較接近,而處于較為南部的江蘇省產地的芫花中瑞香烷型二萜則較少,結合文獻報道的相關依據,我們可以推測作為次級代謝產物的瑞香烷型二萜的含量是和產地、環境因素有關的[14-16]。

本文通過色譜條件的探索研究,建立了簡單、有效的測定芫花中抗腫瘤活性成分瑞香烷二萜的方法,能夠檢測出芫花中抗腫瘤活性成分瑞香烷型二萜較高的含量,為后續更好的對這類二萜的質量控制提供了理論依據。