宮頸脫落細胞miR—125b與宮頸病變關系及其在HR—HPV陽性患者分層篩查中的作用研究

NEELAMSAH 聶小鳳 張琴

摘 要：目的 比較正常宮頸、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌患者宮頸脫落細胞中miR-125b表達水平差異，探討宮頸脫落細胞miR-125b表達水平檢測在HR-HPV陽性患者分層篩查中的作用及其與宮頸病變的關系。方法 采用第二代雜交捕獲技術進行HR-HPV初篩，HR-HPV陽性患者行宮頸液基薄層細胞學檢查及miR-125b檢測。液基細胞學檢查結果異常者直接陰道鏡下活檢行病理學檢查，液基細胞學檢查正常者行陰道鏡檢查，陰道鏡檢查下發現異常者行陰道鏡下活檢取材，余視作宮頸組織學正常，不做宮頸活檢。RT-qPCR檢測正常宮頸及不同級別宮頸病變中miR-125b表達水平，比較不同組織學分組之間的宮頸脫落細胞miR-125b表達水平，繪制ROC曲線，探討miR-125b、液基細胞學檢查在宮頸病變中的診斷作用。結果 宮頸脫落細胞miR-125b水平隨著宮頸病變程度加重逐漸升高（P<0.05）；在HR-HPV陽性患者分層篩查中，宮頸液基細胞學診斷宮頸高級別上皮內病變的敏感性、特異性分別為64.90%、80.70%，AUC為0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001）。與液基細胞學檢查相比，宮頸脫落細胞miR-125b檢測診斷宮頸高級別上皮內病變的靈敏性、特異性更高（87.30% vs 64.90%；69.20% vs 80.70%），AUC為 0.864（95%CI：0.800～0.928，P<0.001）。結論 miR-125b水平隨著宮頸病變加重逐漸升高，檢測宮頸脫落細胞miR-125b水平可有效分流HR-HPV陽性患者，敏感性高于細胞學檢查，可能成為一種有效的分層篩查方法。

關鍵詞：宮頸病變；miR-125b；HR-HPV；宮頸癌篩查

中圖分類號：RR737.33 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.23.021

文章編號：1006-1959（2018）23-0076-04

Abstract：Objective To compare the expression levels of miR-125b in cervical exfoliated cells of normal cervix， cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer， and to explore the role of miR-125b expression in cervical exfoliated cells in stratified screening of HR-HPV positive patients. The relationship between cervical lesions. Methods The second-generation hybridization capture technique was used for HR-HPV screening. The HR-HPV-positive patients underwent cervical-based thin-layer cytology and miRNA125b detection. The results of liquid-based cytology were abnormal. The pathological examination was performed directly under biopsy. The liquid-based cytology was performed by colposcopy. The abnormalities were found under colposcopy. The colposcopy biopsy was performed. Normal， no cervical biopsy. RT-qPCR was used to detect the expression of miR-125b in normal cervical and different grades of cervical lesions. The expression levels of miR-125b in cervical exfoliated cells were compared between different histological groups. ROC curves were drawn to investigate miR-125b and liquid-based cytology. The role of diagnosis in cervical lesions. Results The level of miR-125b in cervical exfoliated cells increased with the severity of cervical lesions （P<0.05）. In the stratified screening of HR-HPV positive patients， the sensitivity of cervical liquid-based cytology in the diagnosis of high-grade intraepithelial lesions of the cervix， The specificities were 64.90% and 80.70%， respectively， and the AUC was 0.728 （95% CI： 0.657～0.779，P<0.001）. Compared with liquid-based cytology， the sensitivity and specificity of cervical exfoliated cells miR-125b for the diagnosis of high-grade intraepithelial lesions of the cervix were higher （87.30% vs 64.90%； 69.20% vs 80.70%）， and the AUC was 0.864 （95%CI： 0.800～0.928，P<0.001）. Conclusion The level of miR-125b is gradually increased with the increase of cervical lesions. The detection of miR-125b in cervical exfoliated cells can effectively divert HR-HPV positive patients， which is more sensitive than cytology and may be an effective stratified screening method.

Key words：Cervical lesions；miR-125b；HR-HPV；Cervical cancer screening

宮頸癌（cervical cancer，CC）是發展中國家女性常見的惡性腫瘤，發病率高且逐年上升[1]，其發生一般需經歷從正常宮頸上皮到不同級別癌前病變的演變過程，平均需5～20年[2]。宮頸癌雖發病率高但其病程進展緩慢，加之宮頸位置易于被暴露和取材，因此是目前唯一可以通過篩查降低浸潤癌發生率的惡性腫瘤。宮頸上皮內瘤變（CIN）是宮頸癌前病變，通過篩查及時發現宮頸上皮內瘤變，及時治療，是預防宮頸癌的有效措施。高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）檢測和宮頸細胞學檢查是目前最主要的兩種宮頸癌篩查方法。HPV檢測具有敏感性高，陰性預測值高，結果客觀可靠等優點，但HPV檢測的最大局限性是陽性預測值低，因此，可能導致陽性婦女產生不必要的心理焦慮，甚至過度診療[3]。宮頸細胞學檢查具有特異性和陽性預測值高的優點，但宮頸細胞學檢查的敏感性較低，結果判斷有較大的主觀性，依賴于經過專業培訓的病理醫生[4]。因此，在HPV陽性婦女中，探索一種新的分層篩查方法具有重要意義。MicroRNAs （miRNAs）是重要的基因調節因子，在多種腫瘤中異常表達。近年來，有研究報道miRNA可作為腫瘤診斷的生物標記物[5]。在宮頸癌發生中，miR-125b因為與E6蛋白作用的靶基因p53密切相關而受到關注[6]。miR-125b水平的升高可代表HPV病毒與宿主細胞的整合，是宮頸發生病變的標識。因此，在本課題中，我們通過檢測HR-HPV感染陽性患者宮頸脫落細胞miR-125b水平，探討miR-125b在不同宮頸病變組織中的表達情況，并進一步與宮頸細胞學檢查比較，探討其在HR-HPV陽性婦女分層篩查中的作用及價值。

1資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年10月～2017年4月至昆明醫科大學第二附屬醫院婦科進行宮頸癌篩查的就診者30000例，本研究經醫院倫理委員會審核通過。年齡25～70歲，平均年齡（37.33±5.28）歲，納入標準：①有性生活史；②研究經患者知情同意，并簽署知情同意書。排除標準：①既往已確診患有宮頸上皮內瘤變，宮頸癌，或其他宮頸惡性腫瘤者；②宮頸不完整，既往行宮頸部分及全部切除者；③年齡<25歲，或>70歲者；④妊娠者。

1.2方法 采用第二代雜交捕獲技術（Hybrid Capture 2，HC2）行宮頸HR-HPV初篩，HR-HPV陽性者行TCT及宮頸脫落細胞miRNA檢查，RT-qPCR方法檢測宮頸脫落細胞中miR-125b表達水平，以宮頸組織學診斷作為分組依據，比較正常宮頸組、LSIL組、HSIL組和CC組miR-125b表達水平差異。TCT結果≥ASCUS者為TCT陽性，TCT陽性者直接陰道鏡下活檢行病理學檢查；TCT陰性者行陰道鏡檢查，陰道鏡異常者陰道鏡下活檢取材。

1.2.1 HPV檢測 由經過培訓的婦科醫生取樣，用HPV采樣器于宮頸管內，同一方向旋轉3周，置于樣品保存液中，4 ℃保存待檢測。采用HC2檢測高危型HPV，具體檢測方法參照生產商的說明。共檢測14種高危型HPV，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68。其結果以標本的相對熒光光度值（RLU）與陽性定標的域值（CO）的比值表示，RLU/CO≥1.0為陽性，反之RLU/CO<1.0為陰性。

1.2.2 TCT檢測 由經過培訓的婦科醫生取樣，應用液基細胞學取樣器，于宮頸管內旋轉 3～5 圈，將宮頸脫落細胞保存在專用的細胞保存溶液中（Cytyc Corporation）。用液基細胞學（LBC）方法行宮頸細胞學檢查。用ThinPrep 2000 processor（Cytyc Corporation）進行液基細胞制片。由本院病理科醫生讀片并做出病理學診斷，宮頸細胞學檢測按照 TBS 分級系統評價標準分類，TCT 結果≥ASCUS者為TCT陽性，反之則為陰性。由2位病理學醫師獨立閱片，當診斷結果不一致時，通過討論得出一致診斷意見。

1.2.3 miR-125b檢測 由經過培訓的婦科醫生取樣，方法與TCT取樣相同，用宮頸細胞取樣專用軟毛刷收集宮頸脫落細胞，樣本保存于Trizol商品化試劑盒，Trizol法提取細胞中總RNA，按照試劑盒說明，應用RT-qPCR法檢測miR-125b表達，以U6作為內參，用2-ΔCt表示miRNA的相對表達水平，2-ΔCt數值越大表示對應的miRNA相對表達水平越高，2-ΔCt數值越小表示對應的miRNA相對表達水平越低。

1.2.4組織學診斷 宮頸活檢獲取的宮頸組織進行常規石蠟包埋、切片、制片，經染色后，由2位病理學醫師獨立閱片，當診斷結果不一致時，通過討論得出一致診斷意見。診斷依據采用2014年第四版WHO女性生殖器官腫瘤分類標準，將疾病分為兩個級別：LSIL和HSIL[7]。當患者活組織檢查結果同時存在多級別宮頸病變時，則按最高級別入組。

1.3統計學處理 采用SPSS 22.0軟件包完成。Mann-Whitney U檢驗分析比較正常宮頸組和LSIL組，LSIL組和HSIL組，HSIL組和CC組miR-125b表達水平差異，以（x±s）表示。構建ROC曲線，分析TCT及miR-125b檢測在HSIL及以上病變診斷中的價值，根據最大約登指數確定miR-125b在診斷HSIL及以上病變的cut off值，比較TCT與miR-125b診斷HSIL的敏感性、特異性。P<0.05 為差異有統計學意義，P<0.001表示統計學意義極顯著。

2結果

2.1宮頸篩查及活檢情況 30000名女性參加HPV-DNA檢測的初篩，其中1140例HPV陽性，最終595例女性完成了TCT和miRNA檢測，其中90例女性TCT結果異常，505例TCT結果未見異常行陰道鏡檢查，結果正常303例、異常202例，最終共292例行陰道鏡下活檢，正常189例，LSIL 29例，HSIL 71例，CC 3例。

2.2宮頸脫落細胞miR-125b表達水平檢測結果比較 隨著宮頸病變程度的增加，miR-125b的表達水平逐漸增高，與正常組及LSIL組相比，HSIL組與CC組均增高（P<0.05），見表1。

2.3 TCT結果與宮頸病變的關系 HSIL組、CC組TCT陽性率高于LSIL組、正常組，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.4 TCT結果對HISL的診斷作用 TCT結果對診斷HISL的靈敏度為64.90%，特異度為80.70%，AUC為0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001），見圖1。

2.5 miR-125b對HISL的診斷作用 miR-125b對診斷HISL的靈敏度為87.30%，特異度為69.20%，AUC為0.864（95%CI：0.800～0.928，P<0.001），cut off值為0.565，見圖2。

3討論

微小RNA（ microR-NA，miRNA） 是一類內源性的非編碼單鏈小分子RNA，長度約為 18～25個核苷酸，可與靶信使 RNA（ mRNA） 3'端非翻譯區（ 3'-UTR） 互補配對結合，進而引起靶mRNA降解或翻譯抑制，調控基因表達，是一類重要的基因轉錄后調節因子，廣泛參與細胞調亡、增殖、分化等多種重要生物學過程[8]。miR-125b是p53基因的負性上游調節因子，miR-125b表達增加將導致p53途徑的失活，因此，導致p53依賴的凋亡激活降低，細胞避免G1期阻滯和DNA修復，細胞不穩定性增加。另外，miR-125b與HPV-L2具有很高的同源性，可以參與病毒DNA合成，促進病毒繁殖，具有病毒基因組的細胞將保持存活狀態，導致HPV基因組重組風險的增加，導致癌前病變風險的增加[9]，因此，miR-125b可能用于識別HR-HPV的持續感染和宮頸病變進展的婦女。

本研究發現，miR-125b在宮頸癌和高級別宮頸上皮內病變中的表達水平高于其在正常宮頸及低級別宮頸上皮內病變中的表達，且miR-125b值隨著宮頸病變加重逐漸升高，提示miR-125b在HSIL預測中發揮一定的作用。在對HSIL預測中，miR-125b檢測與TCT相比較，診斷宮頸病變的敏感性更高（87.30% vs 64.90%），且AUC高于TCT[0.864（95%CI：0.800～0.928，P<0.001）vs 0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001）]。提示miR-125b檢測作為生物標記物用于宮頸癌篩查中HPV陽性的婦女的有效分流的潛在臨床價值，值得進一步研究。本研究的不足之處為研究對象來源于醫院的婦科門診患者，而不是普通人群，這就不可避免地造成了病例構成上的偏倚，因此，本研究的結果需要在一個大樣本普通人群中進一步研究驗證。其次，我們的研究當中最終進行宮頸活檢的有效病例僅292例，活檢病理示正常189例，LSIL 29例，HSIL 71例，CC 3例，樣本量偏少，研究結果的可靠性需要大樣本的研究加以驗證。

綜上所述，宮頸脫落細胞中miR-125b檢測在對HR-HPV陽性婦女分層篩查時的敏感性優于宮頸細胞學檢查，進一步提高了分層篩查價值。但本研究結果是基于到醫院就診的婦女人群，且樣本量偏少，因此，我們的研究結果需要在一個較大樣本的普通人群中進一步研究證實。

參考文獻：

[1]Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66 （2）：115-132.

[2]田其芳.宮頸脫落細胞microRNA檢測在宮頸癌篩查中的作用[D].浙江大學，2014.

[3]王晴，張蓓，印澤遠，等.HPV分型定量檢測對宮頸病變的預測價值[J].現代婦產科進展，2018，27（5）：351-354，358.

[4]杭國紅.薄層液基細胞學檢查、高危型HPV-DNA檢測聯合宮頸脫落細胞p16蛋白檢測在宮頸癌早期篩查中的價值[J].中國婦幼保健，2017，32（22）：5569-5571.

[5]郭金滿，胡火軍，譚園.微小RNA檢測方法在臨床診斷中應用的研究進展[J].廣東醫學，2015，36（5）：809-811.

[6]Nuovo GJ.Strong inverse correlation between microRNA-125b and human papillomavirus DNA in productiveinfection[J].Diagn Mol Pathol，2010，19（3）：135-143.

[7]沈丹華，陳定寶.解讀第4版WHO女性生殖器官腫瘤分類中的變化[J].中華婦產科雜志，2014，49（9）：717-720.

[8]Treiber T，Treiber N，Meister G.Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2018（18）.

[9]Ribeiro J，Sousa H.MicroRNAs as biomarkers of cervical cancer development： a literature review on miR-125b and miR-34a[J].Mol Biol Rep，2014，41（3）：1525-1531.

收稿日期：2018-9-28；修回日期：2018-10-09

編輯/肖婷婷