南充產半夏的蛋白質提取與鑒定研究

彭煜策 趙梅 吳淑菲 江玲 楊俊寶

摘 要：該文以南充產半夏的干燥塊莖為研究對象，采用植物活性蛋白質提取試劑盒提取其總蛋白，通過用考馬斯亮藍快速染色法測定蛋白質濃度，然后用12%的SDS-PAGE變性膠分析南充產半夏的蛋白質組分，再用蛋白質質譜儀測定半夏蛋白質的類型和分子量， 結果得到南充產半夏特有的兩種約22kD和15kD的含量較高的蛋白質組分，且發(fā)現(xiàn)暫未被相應數(shù)據(jù)庫收錄。這為南充產半夏組分的類型與功效的進一步研究奠定了基礎。

關鍵詞：半夏 總蛋白 蛋白質譜鑒定

中圖分類號：R282.7 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2018）06（c）-0223-03

半夏Pinellia ternata（Thunb）Breit具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效，有報道其蛋白質有誘導人肝癌細胞Bel-7402凋亡的作用[1]，半夏蛋白的種類和含量的差異可能是半夏品質的一個評判標準。南充是川產道地藥材川半夏的主產區(qū)，南充產半夏的藥用歷史悠久，國內外馳名，商品成類球形、個大、粉性足[2]。本研究擬用試劑盒提取南充產半夏塊莖的總蛋白質，用考馬斯亮藍快速染色法測定蛋白質的濃度，然后用12%的SDS-PAGE變性膠分析半夏蛋白質的組分，同時用蛋白質譜儀測定蛋白質的類型和分子量，為南充產半夏組分的類型與功效的進一步研究奠定基礎。

1 材料與試劑

1.1 材料

半夏鮮品采自四川南充， 洗凈后經(jīng)川北醫(yī)學院生物學教研室鑒定為正品，然后烘干備用。

1.2 試劑

過硫酸銨（APS）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、溴酚藍、N，N-甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、一步法植物活性蛋白質提取試劑盒購于生工生物工程（上海）有限公司；蛋白Marker、考馬斯亮藍快速染色液購于北京天根公司；實驗用化學藥品均為分析純。

蛋白質譜鑒定委托杭州景杰生物科技有限公司進行，所用試劑由該公司提供。

2 實驗方法

2.1 半夏總蛋白的提取

利用上海生工的“一步法植物活性蛋白質提取試劑盒”提取半夏總蛋白。稱取20mg干燥的半夏塊莖，用研磨棒研磨成粉末，然后將粉末全部轉移到1.5mL的離心管中。加入1mL的蛋白提取混合液，用研磨棒進行研磨，直到看不見明顯的塊莖團塊。然后將混合液渦旋震蕩2min，再4℃，8000rpm離心5min，使有機相和水相分層。最后將槍頭小心伸入到下層水相中，將含有半夏蛋白的下層水相吸出，轉移到一個新的1.5mL的離心管中，此下層水相中即含有半夏的可溶性蛋白，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 半夏蛋白的SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色

取10μL提取的半夏總蛋白液，加入2l 5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液緩慢混勻，金屬浴加熱5min，冰浴備用。將準備好的蛋白樣品上樣到12% SDS-PAGE變性膠的加樣孔內，先50V電泳25min，等樣品全部進入分離膠以后80V 電泳60min。電泳結束后，將PAGE膠取下放入合適的容器中，加入50mL雙蒸水沒過膠面，加熱至沸騰后停止，在脫色搖床上搖動5min，棄去水溶液。加入25mL考馬斯亮藍快速染色液，以浸沒膠面為準，加熱至沸騰后保持沸騰狀態(tài)60sec，停止加熱，在脫色搖床上繼續(xù)搖動5min，棄去染色液。然后加入約50mL雙蒸水，加熱至沸騰后保持沸騰狀態(tài)30sec，停止加熱后繼續(xù)在脫色搖床上搖動8min，換水即完成脫色，觀察結果。

2.3 半夏蛋白的質譜儀測定

另將半夏總蛋白按上述SDS-PAGE電泳方法，待樣品全部進入濃縮膠即停止電泳，切下含半夏總蛋白的膠塊送杭州景杰生物科技有限公司進行蛋白質譜鑒定，操作方法如下所述。

2.3.1 膠內酶解

將含有半夏總蛋白的膠條切碎，使用含50mmol/L碳酸氫銨（NH4HCO3）的50%乙腈（acetonitrile）進行脫色。然后用100%的乙腈共同孵育5min以便將膠塊進行脫水，然后棄去體系中的液相，再加入終濃度為10mmol/L的二硫蘇糖醇（dithiothreitol）溶液，37℃孵育60min。再次使用100%乙腈孵育脫水，移去液相后加入終濃度為55mmol/L的碘代乙酰胺（iodoacetamide），室溫避光孵育45min。之后使用終濃度為50mmol/L的碳酸氫銨清洗，再次使用100%乙腈孵育脫水。最后使用含有10ng/μL胰蛋白酶的50mmol/L碳酸氫銨重懸膠塊，冰上孵育1h。除去樣品中多余的溶液后，將膠塊在37℃酶解過夜。酶解后的肽段依次使用50%乙腈/5%甲酸和100%乙腈提取出膠塊，肽段溶液冷凍旋干后備用。

2.3.2 液相色譜-質譜聯(lián)用分析參數(shù)設置

肽段用含0.1%甲酸和2%乙腈的流動相A溶解后，經(jīng)EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進行分離。流動相B為含0.1%甲酸和98%乙腈的水溶液。液相梯度設置：15min25% B相；23min70%B相；28min80%B相，流速維持在800nL/min。

通過超高效液相系統(tǒng)分離后的肽段被注入到NSI離子源中進行電離，然后用Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Plus質譜對肽段進行分析。離子源的電壓設置為2.0kV，肽段母離子及其二級碎片都使用高分辨的Orbitrap進行檢測和分析。一級質譜掃描范圍設置為350～1800m/z，掃描分辨率設置為70，000；Orbitrap掃描分辨率設置為17，500。數(shù)據(jù)采集模式使用數(shù)據(jù)依賴型掃描（DDA）程序，即在一級掃描后選擇信號強度最高的前20個肽段母離子依次進入HCD碰撞池使用28%的破碎能量進行碎裂，同樣依次進行二級質譜分析。為了提高質譜的有效利用率，自動增益控制（AGC）設置為5E4，信號閾值設置為5000ions/s，最大注入時間設置為200ms，串聯(lián)質譜掃描的動態(tài)排除時間設置為15秒以減少母離子的重復掃描。

2.4 數(shù)據(jù)搜庫

將得到的二級質譜數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 1.3進行檢索。檢索參數(shù)設置如下：數(shù)據(jù)庫設置為UniProt Pinellia ternata （180條序列）；酶切方式設置為Trypsin/P；漏切位點數(shù)設置為2；一級母離子質量誤差容忍度設置為10ppm；二級碎片離子的質量誤差容忍度設置為0.02Da；固定修飾設置為半胱氨酸烷基化；可變修飾設置為甲硫氨酸的氧化和蛋白N端的乙酰化；肽段離子打分要求高于20，鑒定結果peptide confidence設置為High。

3 結果與討論

3.1 半夏總蛋白的SDS-PAGE分析結果

將南充產半夏的總蛋白用12%SDS-PAGE電泳，并經(jīng)考馬斯亮藍染色分析蛋白質組分，得到兩種約22kD和15kD的含量較高的蛋白質組分（見圖1）。

3.2 半夏總蛋白的質譜分析結果

本實驗結合膠內酶解和高分辨生物質譜技術，對膠條樣品中的蛋白混合物進行分析，對半夏總蛋白樣品共鑒定到30個肽段，最終鑒定到7個蛋白，鑒定結果見表1。

3.3 討論

半夏的干燥塊莖具有非常高的藥用價值，其主要含有生物堿、半夏蛋白、β-谷甾醇、氨基酸、多糖、揮發(fā)油及無機元素等多種成分，在這些化學成分中，半夏蛋白是抑菌、抗腫瘤和抗早孕等藥理作用的主要有效成分[3]。已有研究證實半夏凝集素是半夏蛋白的主要成分之一，其基因已被克隆，蛋白大小為29KD[4]。但是在半夏蛋白的提取過程中，鮮、干材料對半夏蛋白提取的質量濃度有不同的影響[3]，這也是在本實驗中進行染色時一些蛋白條帶濃度很低的原因。

本研究利用一步法植物蛋白提取試劑盒成功地提取了南充產半夏的總蛋白質，通過用考馬斯亮藍快速染色法測定了半夏蛋白質的濃度，然后用12%的SDS-PAGE變性膠分析蛋白質組分大小和純度，最后委托杭州景杰生物公司用蛋白質譜儀進行蛋白質質譜鑒定。質譜數(shù)據(jù)根據(jù)已知數(shù)據(jù)庫的搜索結果顯示，共鑒定出其中的7種已知蛋白，但含量豐富的約22kD和15kD的兩種蛋白質組分沒有被鑒定出來。有研究證實，產于不同地方的半夏及半夏的混偽品中各自總蛋白的含量有比較明顯的差異[5]，這提示本研究中未鑒定出的這兩種組分可能是南充半夏具有的特異蛋白質，亦或是序列結構不清楚的兩種新蛋白，其性質與功效有待進一步深入地研究。

參考文獻

[1] 黃必勝.半夏蛋白對人肝癌細胞Bel-7402的誘導凋亡作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（5）：1056-1057.

[2] 白權，李敏，賈敏如，等.南充半夏野生資源調查及品質鑒定[J].川北醫(yī)學院學報，2000，15（4）：47-48.

[3] 張小團，嚴靜，高鴻，等.半夏蛋白的提取工藝及其凝集素的抑菌研究[J].西南師范大學學報：自然科學版，2015，40（6）：43-48.

[4] 趙歡，彭正松，雷楊，等.半夏凝集素基因的克隆、生物信息學分析及其蛋白的亞細胞定位[J].中草藥，2014，45（13）：1914-1919.

[5] 曹艷，黃必勝.半夏總蛋白含量的紫外吸收法測定[J].湖北中醫(yī)雜志，2005，27（7）：48.