木犀草素對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞侵襲遷移的影響及其機制

鐘 燁，王 超，徐 博，劉春輝，陳建立，王曉濤，田 煒，張國志*

(1．華北理工大學附屬醫院，河北 唐山 063000；2．開封市中心醫院，河南 開封 475000；3. 華北理工大學醫學實驗研究中心，河北 唐山 063000)

甲狀腺癌病理類型主要分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌、髓樣癌，其中甲狀腺乳頭狀癌(thyroid papillary carcinoma，PTC)約占甲狀腺腫瘤的60%，近年來發病率呈現逐年增加的趨勢，多發于女性和兒童[1-2]。 PTC主要采用放射性I131和手術切除兩種治療方法，大部分的PTC雖然預后良好，十年生存率達到90%以上，但是部分患者復發率高、預后差，早期遠處淋巴結的轉移增加了手術治療的風險性及其預后的復發率[3]。因此研究出一種副作用低、且有效地抑制PTC淋巴結轉移的藥物成為該領域研究的熱點。木犀草素(luteolin，LUT)是一種天然存在的多酚黃酮，以糖苷形式存在于各種水果和蔬菜中，近年來在有關LUT在腫瘤領域的研究逐漸受到重視[4]。一些富含LUT的植物所衍生的飲食，可能通過一定的藥理學活性發揮抗炎、抗癌、抗過敏等作用，從而在減少一些疾病中發揮重要作用[5]。研究表明，LUT在肝癌、結腸癌、卵巢癌等多種腫瘤中，具有抑制細胞的增殖、侵襲和轉移能力[6-10]。但是LUT在PTC中的作用機制尚不清楚，本研究將不同濃度的LUT與人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞共同培養后，探討LUT對TPC-1細胞侵襲、遷移能力的影響及其可能的機制，從而為甲狀腺乳頭狀癌新藥的開發提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1由天津醫科大學基礎醫學院饋贈，胎牛血清(FBS)、DMEM培養基(Gibco公司)，RNA提取相關試劑盒(日本TaKaRa公司)，聚合酶鏈反應試劑盒、qRT-PCR引物(美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(北京GenStar公司)，兔抗人MMP2、MMP9多克隆抗體(英國Abcam公司)、兔抗人AKT、p-AKT多克隆抗體(美國CST公司)，HR標記的山羊抗兔二抗、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒及相關western試劑盒(上海碧云天公司)，Transwell小室(美國Corning 公司)，Matrigel(北京索萊寶科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)、木犀草素(美國Sigma公司)，用DMSO溶解木犀草素(濃度為100 μmol/L)，實驗中其余藥物濃度的配制均采用培養基稀釋。qRT-PCR儀器(中國香港Gene Company Iimited公司)，高分辨率倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

處于對數生長期的人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞的培養使用含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于飽和濕度37℃、5% CO2孵箱中常規培養。

1.2.2 MTT檢測細胞的增殖活性

首先將處于對數生長期的TPC-1細胞常規傳代培養，然后消化制備成密度為每毫升3×104的單細胞懸液，吹打均勻后取出每孔100 μL(密度每毫升3×104)細胞均勻接種于96孔板中，在每個96孔板周邊加上等量的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)， 放入細胞孵育箱中常規培養，待細胞貼壁后用不含有FBS的培養基同步化。12 h后棄掉培養基，用PBS沖洗3遍，將細胞分為3組，空白對照組中加入DMSO(終濃度小于0.1%)，其余各組加入不同濃度的木犀草素(終濃度分別20 μmol/L, 40 μmol/L)，每組設置9個復孔，結果取9個復孔的平均值。分別培養24 h、48 h、72 h后，加入MTT(濃度為5 mg/mL)溶液10 μL，置于37℃細胞恒溫箱中4 h。棄掉培養基，每孔加入100 μL的DMSO，繼續放入37℃恒溫培養箱的搖床上震蕩反應約10 min。用酶標儀在波長490 nm測量每孔的吸光度(即OD值)，OD值越大，各孔細胞的存活數越多。OD值表示細胞的增殖活性。

1.2.3 Transwell小室法檢測細胞的遷移能力

將空白對照組(加入等量的DMSO)及不同濃度木犀草素(終濃度為20 μmol/L, 40 μmol/L)培養的TPC-1的細胞，消化后制備成單細胞懸液(密度每毫升4×105)。分別取出200 μL/組細胞懸液均勻接種于Transwell小室的上室膜表面，然后取600 μL不含雙抗的10% FBS的DMEM培養基加入下室內。置于細胞孵箱中常規培養，24 h后清除未穿透上室膜表面的細胞，PBS沖洗3遍，將穿過小室膜而黏附于下室面的細胞使用4%多聚甲醛固定30 min以上，蘇木素染色。使用100倍的倒置顯微鏡觀察，隨機選取每組5個視野，計算穿膜細胞數平均值。平行實驗重復3次。

1.2.4 Transwell小室法檢測細胞的侵襲能力

首先制備人工重組基底膜Transwell小室，將不含血清DMEM與Matrigel稀釋按1∶3的比例稀釋，混勻后取稀釋液40 uL均勻涂抹于小室的上室表面，放置37℃恒溫孵育箱過夜，次日紫外線燈下照射30 min。將空白對照組(加入DMSO)及不同濃度木犀草素(20 μmol/L， 40 μmol/L)培養的TPC-1細胞，消化后制備成密度為每毫升5×105的單細胞懸液。其余的步驟按照transwell小室檢測細胞的遷移實驗依次進行。平行實驗重復3次。

1.2.5 Western blotting法檢測蛋白的相對表達水平

LUT處理各組細胞48 h后，將蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑按100∶1混勻后提取TPC-1細胞中總蛋白，BCA法定量蛋白，煮沸5 min變性，于-80℃保存備用，每個泳道按照蛋白量40 μg上樣，12%SDS-PAGE電泳并進行轉膜(90 V，90 min)。轉膜后，脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗(1∶1000)，GAPDH(1∶2000)。4℃過夜后，0.1%TBST洗膜3次(每次10 min)，加入二抗(1∶1000)后室溫孵育1 h，洗膜3次后，用AI600(美國GE公司)成像，ECL熒光顯色。采用Image J軟件分析條帶的灰度值。各組蛋白表達量=(蛋白灰度值/內參灰度值)×100%。

1.2.6 qRT-PCR檢測mRNA的相對表達水平

按TRIpure 說明書提取各組細胞總RNA，逆轉錄后進行PCR擴增。MMP2的上下游基因分別為：5′-3′CCAGCTGGCCTAGTGATGATG和5′-3′CCGCATGGTCTCGATGGTAT。MMP9的上下游基因分別為：5′-3′CGCAGACATCGTCATCCAGT和5′-3′GGATTGGCCTTGGAAGATGA。內參GAPDH上下游引物序列分別是：5′-3′CCTGGAAGATGGTGA TGGGATT和5′-3′GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG。PCR擴增的條件: 預變性95℃ 20 s，變性95℃ 5 s， 60℃ 30 s，延伸72℃ 40 s，共40個循環。以GAPDH為內參，各組的CT值均經過GAPDH校正后，采用2-ΔΔCT法分別計算MMP2、MMP9 mRNA相對表達量。每組設置3個復孔，平行重復實驗3次。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 不同濃度的LUT對細胞增殖活性的影響

用不同濃度的LUT分別處理細胞24 h、48 h、72 h后，MTT結果顯示LUT的濃度越高，作用于細胞的時間越長，細胞的OD值越低(即細胞的增殖活性越低)，木犀草素對TPC-1細胞的抑制作用呈現一定的時間—劑量的依賴性，與空白對照組相比，木犀草素在濃度為20 μmol/L和40 μmol/L時明顯抑制TPC-1細胞的增殖活性，差異有顯著性(P< 0.05)(如表1、圖1)。

表1 不同時間段各組細胞的OD值Table 1 OD values of cells in the groups at various time points

注：與空白對照組相比，*P<0.05。

Note.Compared with blank control group，*P<0.05.

圖1 不同濃度的木犀草素對TPC-1細胞的抑制作用(時間—抑制率)Figure 1 Inhibition of TPC-1 cells by various concentrations of luteolin (time-inhibition rate)

2.2 不同濃度的LUT對細胞侵襲、遷移能力的影響

注：A：細胞遷移能力的變化(×100)；B：細胞侵襲能力的變化(×100)；a1和b1為空白對照組，a2和b2為LUT 20 μmol/L group，a3和b3為LUT 40 μmol/L group；C圖是各組細胞穿透的細胞數；與空白對照組相比，*P<0.05。圖2 transwell小室檢測各組穿透的細胞數Note. A: Change of cell migration ability(×100); B: Changes of cell invasion ability(×100); a1 and b1 are blank control group, a2 and b2 are LUT 20 μmol/L group, a3 and b3 are LUT 40 μmol/L group; C: the number of cells penetrated of each group; compared with the blank control group, *P < 0.05.Figure 2 Transwell chamber to detect the number of cells penetrated of each group

細胞體外遷移實驗結果示：與空白對照組穿膜的細胞數(50.66±6.73)相比，LUT 20 μmol/L(35.33±7.05)顯著降低，P<0.05；LUT 40 μmol/L (18.35±6.02) 顯著降低，P<0.05。此外細胞侵襲實驗結果示：與空白對照組穿透細胞數(32.33±7.50)相比，LUT 20 μmol/L(24.66±7.02)顯著降低，P<0.05；LUT 40 μmol/L(12.67±8.03)顯著降低，P<0.05，LUT可以明顯抑制TPC-1細胞遷移和侵襲能力。(圖2)

2.3 LUT對各組細胞中AKT、P-AKT、MMP2、MMP9蛋白表達的影響

LUT作用于細胞48 h后提取細胞總的蛋白，各組中AKT蛋白的相對表達量無明顯差異(P>0.05)；但與空白對照組相比，LUT濃度為20 μmol/L和40 μmol/L細胞中P-AKT、MMP2、MMP9蛋白的相對表達量均明顯降低(均P<0.05)(圖3)。

2.4 LUT對各組細胞MMP2、MMP9 mRNA表達的影響

不同濃度的木犀草素干預各組細胞后，qRT-PCR結果顯示(如圖4)，木犀草素濃度為20 μmol/L和40 μmol/L組的MMP2、MMP9 mRAN相對表達量均明顯低于空白對照組，差異具有統計學意義(均P<0.05)。

3 討論

木犀草素(3′，4′，5,7-四羥基黃酮)是許多類型

注：與空白對照組相比，*P<0.05。圖3 LUT對各組細胞中AKT、p-AKT、 MMP2、MMP9蛋白水平的影響(n=3)Note. Compared with the blank control group, *P<0.05.Figure 3 Luteolin influences the protein expression of AKT, p-AKT, MMP-2, and MMP-9

注：與空白對照組相比，*P<0.05。圖4 LUT對各組細胞中MMP2、MMP9 mRAN水平的影響(n=3)Note. Compared with the blank control group, *P<0.05.Figure 4 Luteolin influences the mRNA expression of MMP-2 and MMP-9

植物中常見的類黃酮，以不同形式廣泛地阻止腫瘤細胞的增殖和遷移，在胃癌、肝癌、宮頸癌等腫瘤中可通過阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡等多種方式發揮著抑制腫瘤生長的作用，是一種有效的抗癌劑[11-14]。本研究通過MTT法觀察LUT對TPC-1細胞增殖活性的影響，結果表明與空白對照組相比，木犀草素濃度為20 μmol/L和40 μmol/L時均可以有效地抑制TPC-1細胞的增殖活性(P<0.05)，這與不同濃度的木犀草素抑制人胃癌細胞增殖活性作用的結果相一致[12]。

研究表明，侵襲及轉移在PTC中的發病機制中占有重要的作用[15]。在腫瘤細胞中，基質金屬蛋白酶(MMPs)分泌的MMP包括明膠酶A(MMP2)和明膠酶B(MMP9)，通過降解細胞外基質屏障(ECM)不僅參與腫瘤細胞的侵襲轉移，而且涉及血管生長、炎癥、癌癥的進展等[16]。研究發現，在PTC中基質金屬蛋白酶2、9(MMP2、MMP9)呈現高表達，參與調控腫瘤細胞的浸潤及侵襲轉移[17-18]。研究證實在甲狀腺乳頭狀癌中磷脂酰肌醇-3激酶PI3K/AKT信號通路可調節MMPs活性，從而參與腫瘤細胞侵襲和轉移等作用[19-20]。

在膠質母細胞瘤中，LUT通過影響PI3K/AKT信號通路的活性達到抑制腫瘤細胞的侵襲遷移能力[21]。在乳腺癌中，木犀草素具有較強的抑制血管生成的作用，通過下調AEG-1和MMP-2的表達抑制乳腺癌細胞的侵襲活性[22]。在卵巢癌中，木犀草素可以有效地抑制卵巢癌細胞的侵襲遷移能力，其機制可能與MMP2和MMP9的表達水平的降低有關[23]。在前期研究表明不同濃度的木犀草素可以抑制TPC-1細胞的增殖活性，在此基礎上本研究通過采用木犀草素與人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞共培養，體外侵襲遷移實驗結果顯示與空白對照組相比，木犀草素在濃度為20 μmol/L和40 μmol/L時細胞的侵襲及遷移能力明顯受到抑制，差異有顯著性(P<0.05)。進一步探討LUT對抑制人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞侵襲遷移相關機制，Western blotting結果顯示與空白對照組相比，木犀草素濃度為20 μmol/L和40 μmol/L組中的腫瘤相關蛋白MMP2、MMP9及PI3K/AKT信號通路相關蛋白P-AKT的表達水平明顯降低，qRT-PCR結果進一步表明MMP2、MMP9的mRAN也明顯減少，差異有顯著性(均P<0.05)。該結果與不同濃度的木犀草素有效地抑制肝癌、乳腺癌、前列腺癌、膠質母細胞瘤等腫瘤細胞侵襲遷移能力的研究結果相一致[8, 21,24-25]。

總之，本研究表明LUT可以有效地抑制甲狀腺乳頭癌TPC-1細胞的侵襲遷移能力，這一作用可能與PI3K/AKT信號通路的活性改變有關，這為LUT在PTC的治療中提供了一定的理論依據，有望作為一種新型抗甲狀腺乳頭狀癌的藥物在臨床中應用。