Tlr4基因敲除小鼠生長和繁殖的實驗研究

鄭 洋，王佳慧，劉露露，黎桂玉，彭 岳，趙鐵建*

(1.研究生學院；2.基礎醫學院；廣西中醫藥大學, 南寧 530001)

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類天然免疫受體，能引發一系列信號轉導，導致炎性介質的釋放，在天然免疫防御中起重要作用[1]。其中TLR4是人類發現的第一個TLRs相關蛋白，革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)是其主要配體[2-3]。近年研究發現，TLR4表達于各類肝臟細胞中，可以調節肝臟細胞的天然免疫反應，參與肝臟的病理生理過程，在肝臟疾病的發生發展中發揮重要作用[4]。為了深入研究肝纖維化的發病機制，本課題組購買了Tlr4基因敲除的小鼠，在造肝纖維化模型前的飼養階段，研究人員發現Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠在生長和繁殖方面具有一些差異，所以本文將兩種小鼠進行比較，為研究Tlr4基因在肝纖維化形成過程中的作用，提供更加完整詳細的實驗數據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級Tlr4基因敲除小鼠20只，雌雄各半，2周齡，體重4～10 g，購買于南京大學-南京生物醫藥研究院，種系為C57BL/10ScNJNj，合格證號[SCXK(蘇)2015-0001]，清潔級KM小鼠20只，雌雄各半，2周齡，體重10～15 g，購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號[SCXK(湘)2016-0002]。使用許可證號[SYXK(桂)2015-0001]。按照實驗動物使用的3R原則予以人道關懷。

按照清潔級動物的環境要求飼養兩個小鼠品系，環境中溫度25℃左右，相對濕度控制在30%～60%，小鼠籠和飲水瓶每3 d用84消毒液和75%酒精消毒一次，鼠籠的墊料、飼料、水均經滅菌處理，墊料3 d更換一次。兩個小鼠品系均采用一雌一雄同籠進行繁殖。

1.2 主要儀器

電子天平HLD-10001(四川中浪科技有限公司)，最大稱重重量為1000 g，精度為0.1 g。卡尺A635051(上海艾測電子科技有限公司)，范圍為0～150 mm，分辨率為0.05 mm。

1.3 實驗方法

在周齡剛好達到時測量體重和體長。體長指雙耳連線的中點到尾體交接處，體長測量需借助于不銹鋼網，當小鼠在網上抓緊時，拉住它的尾巴使其自然伸直，然后進行測量。增長率=(體重或體長-第2周的體重或體長)/第2周的體重或體長。從第4周開始一直測量到12周結束，因為小鼠的哺乳期約為3周，在6周齡的時候是性成熟的時間段，所以選擇快速進展期的小鼠進行測量。繁殖能力的測量對象是一雄一雌所產的第2胎的幼仔數量，可代表繁殖能力[5-6]。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠生長的比較

2.1.1 小鼠體重及其增長率的比較

Tlr4基因敲除小鼠體重及其增長率明顯小于KM小鼠，從第4周到第12周差異顯著(P< 0.05)，詳細見表1～2。

2.1.2 小鼠體長及其增長率的比較

在第4周和第5周兩者相比差異不明顯，P> 0.05；在其它的時間段，Tlr4基因敲除小鼠體長及其增長率明顯小于KM小鼠，P< 0.05。具體見表3～4。

表1 Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠體重比較(g, n=20)Table 1 Comparison of the body weight of Tlr4 knockout mice and KM mice

注：兩者相比差異顯著，*P< 0.05。

Note. There were significant differences between the two,*P< 0.05.

表2 Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠體重增長率比較(%，n=20)Table 2 Comparison of the body weight growth rates between Tlr4 knockout mice and KM mice

注：兩者相比差異顯著，*P< 0.05。

Note. There were significant differences between the two,*P< 0.05.

2.2 小鼠繁殖能力的比較

在Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠的群體中，隨機選取20籠一雄一雌合籠的小鼠為研究對象，統計其第2胎所產的幼仔個數，具體見表5，Tlr4基因敲除小鼠繁殖能力明顯小于KM小鼠，P< 0.05。

3 討論

本課題組用Tlr4基因敲除小鼠制備肝纖維化模型，研究Tlr4如何通過NF-KB、MARKs兩條信號通路在肝臟炎癥反應中發揮作用，Tlr4基因敲除小鼠成本高昂，而在制備肝纖維化模型過程造中，小鼠死亡率較高，因此如何更好的飼養以及將基因敲除小鼠品系保存下去，具有十分重要的意義。本研究發現Tlr4基因敲除小鼠在生長和繁殖均弱于正常KM小鼠,而Tlr4已經證實和多種疾病的發生相關，例如肝纖維化，如果研究Tlr4和肝纖維化之間的關系，Tlr4基因敲除小鼠則是理想的動物模型，因為Tlr4通過MyD88調控NF-κB、MAPKs兩條信號通路[7]，當Tlr4基因被敲除后，這兩條通路的信號傳導被阻斷，通過對信號通路中的關鍵分子檢測，可以得到疾病相關的分子機制，以及Tlr4和肝纖維化之間的關系。所以正確的飼養，對于Tlr4基因敲除小鼠的獲得和保種十分重要。在飼養Tlr4基因敲除小鼠的過程中，報告發現有食子的現象，有研究表明很多基因敲除小鼠都有食子現象[8]，根據李巍[9]的飼養方法進行改良，減少每天觀察小鼠的次數，這樣可以減少對小鼠的驚嚇，給予花生米、葵花籽以及熟雞蛋黃發現食子現象得到很好的緩解，另Tlr4基因敲除的小鼠比KM小鼠對環境的要求更高，在飼養過程中，如果消毒不及時或者對飼養環境的衛生處理不得當，基因敲除小鼠會出現死亡的現象，筆者認為這可能和其Tlr4基因敲除，使其免疫力下降有關，有研究表明TLR4與免疫力的關系密切[10]。TLR4是TLR4信號通路中的關鍵分子也可以調控NF-κB、MAPKs信號通路，這些信號通路都是炎性通路。有研究表明[11]，發生炎性疾病時，使用藥物抑制TLR4表達后疾病的嚴重程度下降。但當敲除Tlr4基因后，免疫細胞表面沒有TLR4的表達，TLR4與病原體的結合受到阻礙，將影響機體的適應性免疫應答[12]。所以Tlr4基因敲除后會對小鼠的生長產生很大的影響。

表3 Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠體長比較(cm, n=20)Table 3 Comparison of the body length of Tlr4 knockout mice and KM mice

注：兩者相比差異顯著，*P< 0.05。

Note.There were significant differences between the two,*P< 0.05.

表4 Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠體長增長率比較(%，n=20)Table 4 Comparison of body length growth rates between the Tlr4 knockout mice and km mice

注：兩者相比差異顯著，*P< 0.05。

Note. There were significant differences between the two,*P< 0.05.

表5 Tlr4基因敲除小鼠與KM小鼠繁殖能力(幼仔個數)比較Table 5 Reproductive performance(number of cubs)of the Tlr4 knockout mice and KM mice

注：兩者相比差異顯著，*P< 0.05。

Note. There were significant differences between the two,*P< 0.05.

本研究發現Tlr4基因敲除對小鼠生長和繁殖的影響，在體重和其增長率上Tlr4基因敲除小鼠明顯小于KM小鼠，在體長和其增長率上在第4周和第5周時，兩個小鼠品系差異不明顯，在其它的時間段Tlr4基因敲除小鼠明顯小于KM小鼠，在繁殖上Tlr4基因敲除小鼠明顯弱于KM小鼠。