用于評價大小鼠學習記憶能力的迷宮實驗方法比較

楊玉潔，李玉姣，李杉杉, 劉新民，王 瓊 *

(1.西南醫科大學 附屬中醫醫院 中葡中醫藥國際合作中心，四川 瀘州 646000；2.西南醫科大學 藥學院 藥理教研室，四川 瀘州 646000；3.中國醫學科學院 & 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

評價大小鼠學習和記憶能力時，迷宮類實驗是最經典、最常用的檢測手段，根據實驗原理一般可分為水迷宮、電迷宮、食物迷宮等。迷宮最早出現于19世紀末，美國心理學家桑代克的小貓迷籠實驗，是研究動物心理學的開端，也是迷宮實驗的最早應用。后來逐漸發展，出現了其他各式各樣的迷宮。本篇綜述通過搜集Morris水迷宮、Y迷宮、八臂迷宮、T迷宮、Barnes迷宮實驗的實驗方法、實驗原理、注意事項、評價指標、應用特點，分析各自優缺點，為更好利用迷宮實驗評價大小鼠學習記憶能力提供參考。

1 五種迷宮簡介

1.1 Morris水迷宮

Morris水迷宮是利用大小鼠會游泳又怕水的天性，強迫其在水中游泳，依靠空間參考標志判定平臺的位置擺脫水環境。實驗模式有三種：定位航行模式、空間探索模式、工作記憶模式。定位航行實驗時，動物從不同象限的中點放入迷宮，記錄其登上平臺的時長(潛伏期)。空間探索實驗考察其對平臺位置的記憶，記錄動物的穿臺次數。工作記憶模式是定位航行實驗后，每天改變平臺位置，給予動物5～10 s的觀察時間，檢測動物在短時間內對平臺新位置的記憶(即工作記憶)。

注意事項：(1)實驗人員勿隨意走動，室內物品位置勿變動。(2)小鼠實驗時水溫維持在20℃～23℃，水溫過高，則小鼠不愛游動。大鼠因體積大，耗能多，水溫在24℃～26℃之間。(3)實驗前水中加入墨汁或牛奶、無毒的涂料，更好地隱匿平臺。(4)實驗前后，將動物置于平臺上休息一段時間，使動物觀察迷宮四周環境，幫助記憶。(5)防止動物因視覺問題影響尋臺，可在水迷宮實驗前或后進行可視平臺實驗。(6)平臺應放置在象限的中間，不要放置在水池邊緣，避免動物按邊緣式搜索策略無意找到平臺。

1.2 Y迷宮

Y迷宮可進行兩種實驗：電Y迷宮實驗，Y迷宮自主交替實驗。

電Y迷宮實驗是利用鼠類避明趨暗的習性設計的一種條件反射實驗裝置，其三條臂內均裝有燈泡和電網，燈亮的臂無電，而暗臂有電，隨機更換安全臂訓練動物的空間辨別學習能力。實驗分為三個階段，先是訓練期，當動物主動逃避次數達到80%以上，則可進入測試階段，最后還可進行記憶再現階段。訓練期記錄動物達到學會標準進行的電擊總數和動物出錯總數，作為學習的評定指標。測試期統計動物足底電擊中的出錯總數，作為記憶的評定指標[1-3]。記憶保持是考察動物經過一段時間后再放入迷宮，以評價動物記憶力的高低。

Y迷宮自主交替實驗，完全利用嚙齒類動物對新奇環境探索的天性，動物必須依靠前一次的記憶做出正確的進臂選擇，可有效地評價動物的空間工作記憶能力。實驗時將動物放入一條臂的末端，讓其自由探索幾分鐘，一段時間后將動物再次放入迷宮進行正式檢測。記錄動物進入各臂的順序和總次數，當連續三次進入不同的臂時，記為一次正確交替反應，統計正確交替反應次數[4]，計算自主交替率。注意事項：對于電Y迷宮，應選擇合適的電壓。

1.3 T迷宮

T迷宮是依靠覓食動機誘導動物完成任務的一種迷宮，檢測前需對動物進行禁食。實驗中，動物對目標臂的選擇基于記住上次探索過的目標臂，即空間工作記憶，動物對目標臂的正確交替選擇是完整工作記憶能力的體現[5]。T迷宮包括自發連續交替實驗和交替選擇實驗兩種模式[6]，自發連續交替實驗模式時，動物不用禁食，完全借助其愛探索的天性。先讓動物完全適應迷宮后，進行一次初始強制實驗和六次選擇實驗，即關閉其中一條目標臂，動物從起始箱放入，使其探索另一條開放的目標臂，待進入目標臂后，又重新放回起始箱。10 s后開放閘門，讓其自由探索兩條目標臂，待其進入其中一條臂后，關閉另一條臂，再次放回起始箱，10 s后進入下一次選擇實驗，循環進行六次。而交替選擇實驗模式是動物禁食后，進行7～8 d的適應性訓練和1 d的正式訓練，即適應迷宮后，在兩條目標臂中隨機選擇一條臂末端放入食餌，關閉另一條臂。將動物放入起始箱，使其進入目標臂獲取食餌，連續訓練一段時間后(保證左右兩臂放食餌的次數相等)進入正式實驗階段[7]。先是強迫訓練，選擇一條臂開放并放入食餌，另一條臂關閉，當動物進入有食餌的臂獲得獎勵后，將其馬上放回主干臂，而后讓其自由探索左右兩臂，此前強迫訓練時放食餌的臂中無食餌，其對側臂有食餌。動物若進入無食餌的臂，記為一次“錯誤次數”，反之為“正確次數”，重復測試多次。統計總的正確率，正確率越高，潛伏期越短，表明動物工作記憶越好[8]。注意事項：當為交替選擇模式時，動物須禁食，至體重減輕為原來的85%～90%，促使動物覓食。

1.4 八臂迷宮

八臂迷宮以動物尋覓不同臂中的食餌來評價其空間學習記憶能力，實驗分為訓練期和檢測期。訓練期：將食餌放入八條臂末端食盒內，動物從中央區放入，讓其自由尋覓食餌。重復訓練多天，記錄動物進臂次數，訓練期反映的是依賴海馬有關的陳述性記憶[9]。檢測期：隨機在4條臂中放入食餌，另外4條臂關閉，動物限定時間內探索4條開放臂，待動物獲得全部食餌后將其放回中央區等待一段時間后，開放迷宮八條臂進行測試(之前沒放食餌的臂放入食餌)。檢測期主要反映了依賴紋狀體的習慣性記憶[10]。注意事項：(1)每天訓練完后，將整個迷宮旋轉180°，防止動物依靠反向記憶記住空間位置。(2)迷宮周圍的所有物品位置需保持不變，防止動物定位不準確。

1.5 Barnes迷宮

Barnes 迷宮是利用嚙齒動物喜暗避明的習性設計，通過強光照射與噪聲刺激迫使動物在規定時間內尋找指定位置孔洞下的暗箱。實驗分為訓練期和測試期，連續訓練幾天后測試，記錄動物進入暗箱的時間、總路程、速度等[11]，以及進入錯誤洞口的次數以反映動物空間參考記憶能力，也可以通過記錄動物重復進入錯誤洞口次數來測量動物的工作記憶。注意事項：每次訓練后要隨機轉動迷宮，保證連續兩天迷宮位置不同，但目標箱位置不改變。當動物在其他洞旁徘徊時，其頭部伸入洞內，眼睛低于平臺邊緣時，判斷為逃生錯誤[12]。

2 五種迷宮實驗方法比較

表1 五種迷宮實驗方法及應用列表Table 1 Five maze tests and their applications

表2 五種迷宮的優缺點比較Table 2 Comparison of the advantages and disadvantages of the five mazes

3 迷宮實驗評價動物學習記憶能力的研究

鄭紅[19]等人發現重復Morris水迷宮訓練能提高動物空間學習能力，但不提高動物空間記憶能力，這說明空間學習和空間記憶能力有不同的機制，兩者之間無必然聯系。此外，動物的品系、年齡、性別都會影響動物在水迷宮實驗中的表現，C57BL/6小鼠的參考記憶能力和工作記憶能力均比昆明種小鼠和ICR小鼠表現稍好[20]。雌性C57BL/6小鼠和昆明小鼠在參考記憶中的表現明顯優于同品系雄性小鼠。而BALB/c小鼠不適合進行Morris水迷宮實驗[21]。此外，6月齡SD雌性大鼠比2月齡的尋臺潛伏期短，而SD雄性大鼠的學習記憶能力也在6月齡時最好，6月齡之前呈現逐漸增強趨勢，以后緩慢下降，至24月齡時降至1月齡水平，說明SD大鼠，不管雄性還是雌性，其學習記憶能力在 6月齡時最強[22]。

Y迷宮除了檢測空間學習記憶外，還可檢測動物對空間位置覺和方向覺的辨別能力、逃避條件反射能力、空間工作記憶(一種短期記憶)和片段式記憶[23]。

八臂迷宮用于評價實驗動物的空間記憶和非空間記憶，能很好的區分參考記憶和工作記憶。在大量疾病動物模型研究中均有應用，包括長期高脂飲食模型、睡眠剝奪模型[24]、腦創傷模型，尤其對多種發育毒性物質敏感，也有在猴子和人的研究中應用[25]。

T迷宮既可以檢測實驗動物空間學習和記憶能力，也可利用自發交替實驗檢測動物空間工作記憶能力，自發交替是一個短期的記憶任務，評估動物對之前進入過迷宮臂的記憶能力，并在重新進入迷宮臂時選擇另一條臂。在應用T迷宮和Barnes迷宮對腦缺血模型進行研究時，發現腦缺血引起的神經認知缺陷與工作(短期)記憶密切相關，而對長期參考記憶影響較小。Barnes迷宮是用于檢測動物的視覺空間學習和記憶能力[26]。

4 迷宮實驗評價學習記憶的相關機制研究

大量研究已證實學習記憶和海馬關系密切，紋狀體邊緣區與前額葉皮質也參與學習記憶過程。當海馬或海馬周圍區域損傷時，會出現空間定位記憶障礙。動物海馬體中含有細胞外基質金屬蛋白酶(MMPs)，其在中樞神經系統病理過程中起重要作用，主要的MMP3與MMP9參與空間學習記憶過程，研究表明抑制海馬體中MMP3和9活性會顯著降低獲取空間記憶任務的能力[27]。另外，海馬中BDNF mRNA表達水平也與海馬依賴性空間記憶有關[28]。海馬內神經元的凋亡對空間學習記憶也有顯著損傷[29]，通過抑制caspase-3和促進海馬體CA1區域神經元bcl-2的表達，是一種很好的改善認知的方法。在糖尿病伴發學習記憶障礙的研究中，模型動物在早期會出現空間學習記憶能力減退，工作記憶和參考記憶處理速度減緩，這與腦內N-甲基-D-天冬氨酸受體 (NMDARs) 表達的激活有關，高血糖會引起腦組織缺血缺氧，谷氨酸大量釋放并過度刺激NMDARs受體，最終導致神經元細胞的減少[30]。此外，海馬僅參與電Y迷宮逃避性學習記憶任務鞏固的早期階段，而紋狀體邊緣區參與學習記憶任務鞏固的早期和晚期階段[31]。研究表明背側海馬區受損對T迷宮中視覺操作辨別任務影響不大，但會嚴重影響延遲交替任務；而背側紋狀體區受損會嚴重損害視覺操作辨別任務，但對延遲交替任務的完成無影響。除海馬體和紋狀體外，前額葉皮質與學習記憶密切相關，尤其在工作記憶上[32]。內側前額葉皮質內與空間工作記憶相關的神經元編碼會介導大鼠在T迷宮中延遲交替響應任務的選擇行為[33]。

5 討論

除了文中的五種迷宮外，近年也出現幾種新型迷宮，如八臂水迷宮、Y型水迷宮等，這種多臂型水迷宮對檢測輕度學習記憶能力下降的敏感性比Morris迷宮強，也避免了在Morris水迷宮中的趨觸性行為(即靠池邊游泳的傾向)。

為了更好的研究與神經科學相關的疾病，選擇合適的認知行為學實驗進行研究十分重要。在評價海馬依賴性的空間學習和記憶功能時，Morris 水迷宮、Barnes迷宮均適合，它們具有一個共同的特點：在一個大的開放性的圓形空間內找到一個離散的目標。Morris迷宮是讓動物在一個安靜的環境中進行空間巡航任務，而Barnes迷宮使動物處于強光或噪音下去完成任務，這可能會分散動物尋找空間線索的注意力，影響實驗的準確性[34]，所以Morris水迷宮的實驗結果更可靠。同時，有大量研究采用Morris水迷宮來評價動物的工作記憶，但有研究者指出Morris水迷宮在工作記憶能力檢測上的不敏感性，考慮到Y迷宮(自發交替實驗)和T迷宮操作簡便，用時少，更適合用于檢測大小鼠的工作記憶。Y迷宮有多種實驗模式，研究者們開始減少使用電刺激和飲食限制的實驗方法，而采取利用嚙齒類動物天生的探索心理去完成迷宮任務，可用于評價動物空間識別記憶能力[35]。放射迷宮既可用于檢測空間記憶能力，也可檢測動物的工作記憶能力，其以動物覓食天性為原理，雖避免了厭惡刺激，但這種食物誘導動機可能導致結果的不可信，同樣的其他食物迷宮也有相同的問題[36]。目前，迷宮實驗主要應用于大小鼠上，而對其他哺乳動物的研究和應用上較少，所以應加大對非人靈長類動物迷宮類實驗的研發與應用。