TLR4在膿毒癥中對調節性T細胞功能活性的影響

黃穎，曹超，王軍，壽松濤

（天津醫科大學總醫院急診科，天津 300052）

膿毒癥指“機體對感染反應失調所引起的危及生命的器官功能障礙”[1]。研究調查顯示，膿毒癥具有高發病率及高致死率的特點[2]，已成為現代危重病急救醫學面臨的世界性難題。膿毒癥發病機制非常復雜，免疫功能紊亂貫穿于膿毒癥病理過程的始終，宿主的免疫功能狀態在很大程度上決定著炎癥反應的預后。Toll樣受體4（Toll-like receptors4，TLR4）可特異性識別革蘭氏陰性菌表面的內毒素(lipopolysaccharide，LPS），而 LPS 是誘發膿毒癥感染主要的致病原。調節性T細胞是一類具有負向免疫調控作用的T細胞亞群，其功能及活性變化影響著膿毒癥免疫功能紊亂的預后[3-4]，但其作用機制尚不明確。本實驗通過盲腸結扎穿孔術這一經典術式復制膿毒癥模型，結合Treg在免疫功能障礙中的作用，探討TLR4在膿毒癥中對Treg功能及活性的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性健康SPF級C57/BL6小鼠 40只，C57BL/10ScNJNJ（TLR4-/-）小鼠 40 只，6～8 周齡，體質量約（20±2）g，均購于南京大學模式動物研究所，合格證號：scxk（蘇）2010-001。小鼠飼養于天津醫科大學總醫院動物實驗室，室溫20～25℃，相對濕度40%～50%，正常日光燈照射12 h維持晝夜循環，實驗開始前適應性飼養1周，無菌飼料喂養，正常進食，自由飲水。各組別用隨機數字表法將小鼠分為Sham組、CLP組、TLR4-/-Sham組、TLR4-/-CLP夜循環，實驗開始前適應性飼養1周，無菌飼料喂養，正常進食，自由飲水。各組別用隨機數字表法將小鼠分為Sham組、CLP組、TLR4-/-Sham組、TLR4-/-CLP組，各組別20只。

1.2 研究方法

1.2.1 造模 采用盲腸結扎穿孔（cecal ligation puncture，CLP）建立膿毒癥模型。腹腔注射1%戊巴比妥鈉80 mg/kg麻醉，取腹正中做1 cm切口，切開皮膚、腹肌、腹膜進腹，找到盲腸，將其輕輕拉出腹腔外，在盲腸中部結扎（結扎長度約1～1.5 cm），18G注射器針頭貫穿結扎遠端，擠出少量腸內容物，以確保穿孔，將處理后的盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口，術后于皮下注射1 mL生理鹽水液體復蘇，Sham小鼠手術不予環形結扎及針刺穿孔，余與CLP組相同。

1.2.2 檢測Treg計數與凋亡率 術后24 h，分離小鼠脾淋巴細胞，加入10 μL Biotin抗體，混勻，4℃預冷孵育10 min，然后加入20 μL抗-Biotin抗體、10 μL CD25-PE抗體混勻，離心洗滌。PBS緩沖液重懸后，加10 μL抗-PE磁珠混勻，4℃避光預冷經分選，收集流出CD4+CD25-Treg細胞，在含有5%CO237℃的孵育箱中孵育24 h后計數，加入Foxp3-FITC抗體（Bioscience）標記，避光孵育30min，流式細胞儀檢測CD4+CD25-Treg凋亡。

1.2.3 檢測Foxp3mRNA及TLR4mRNA的表達水平 MiniMACS免疫磁性分離系統分選各組CD4+CD25+Treg細胞，按Trizol試劑盒（美國Promega公司）操作說明，采用Trizol法提取總RNA并擴增，反轉錄（美國Promega公司）合成cDNA。采用熒光定量PCR儀進行PCR擴增。PCR反應條件：95℃預變性 1 min，95℃變性 15 s，60℃退火/延伸 40 s，共40個循環。Foxp3上游引物：5′-CAGCTGCCTACA GTGCCCTAG-3′；下游引物：5′-CATTTGCCAGCAGT GGGTAG-3′；TLR4 上游引物：5′-TTTCACCTCTGC CTTCACTA-3′；下游引物：5′-AGATACACCAACGGC TCTGAAT-3′。分光光度儀檢測Foxp3mRNA及TLR4mRNA的表達水平。PCR引物購于伯研合眾（天津）生物醫藥科技有限公司。

1.2.4 檢測Treg細胞的Foxp3、TLR4蛋白活性的表達 分離各組小鼠Treg，收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞，100 μL PBS重懸細胞，加入Anti-MouseCD152/CTLA-4-FITC 10 μL，4℃避光孵育后流式細胞儀檢測；用同樣的方法收集、洗滌、重懸Treg細胞。按Foxp3試劑盒操作說明將細胞破膜劑稀釋4倍，每106細胞加入固定/穿透工作溶液1 mL重懸，4℃避光孵育2h。破膜緩沖液洗1～2次，之后將細胞懸浮于200μLPBS中通過流式細胞儀檢測。

1.2.5 Western Blot檢測 Treg 細胞內 NF-κB、p-NF-κB的水平 分離各組小鼠Treg，收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞，按照操作說明（Well-bio，上海）提取蛋白，轉膜后用5%脫脂牛奶封閉，按說明書推薦比例稀釋抗體NF-κB、p-NF-κB，在4℃下過夜。用TBST洗膜后用辣根過氧化物酶孵育抗體（1:6 000，Bio-Rad，美國）。用增強化學發光（ECL）（日本Millipore）對膜上的帶密度進行了掃描和分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0統計學軟件進行數據分析，各組標準化的樣本數值用x±s，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05或P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Treg計數及凋亡率變化 由表1可見，與Sham組相比，WT CLP組及TLR4-/-CLP組Treg數量均增多（P＜0.05），但兩組中WT CLP組增多更明顯（P＜0.05）。與Sham組相比，WTCLP組Treg細胞凋亡率明顯下降（P＜0.05），而TLR4-/-CLP組較WTCLP組 Treg凋亡率升高（P＜0.05）。

表1 各組小鼠脾臟Treg計數及凋亡率Tab 1 Treg count and apoptosis rate in each group

2.2 Foxp3mRNA及TLR4mRNA的表達水平 由圖1可見，與WT Sham組相比，WT CLP組小鼠Treg細胞內Foxp3mRNA及TLR4mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）。與 TLR4-/-Sham 組相比，TLR4-/-CLP 組Foxp3mRNA及TLR4mRNA表達水平無明顯變化（P＞0.05）。與 WTCLP 組相比，TLR4-/-CLP 組小鼠Foxp3mRNA及TLR4mRNA水平則顯著降低（P＜0.05）。

2.3 Treg細胞Foxp3、TLR4蛋白表達水平 如圖2所示，與WT Sham組相比，WTCLP組Treg細胞Foxp3及TLR4表達量明顯增加（P＜0.05）。與TLR4-/-Sham組相比，TLR4-/-CLP組Foxp3及TLR4的表達無明顯差異（P＞0.05）。與WTCLP 組相比，TLR4-/-CLP組Foxp3及TLR4表達量顯著減少（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠Treg細胞內Foxp3mRNA及TLR4mRNA的表達水平Fig1 The expression of Foxp3mRNA and TLR4mRNA in Treg of each group

圖2 各組小鼠Treg細胞Foxp3、TLR4蛋白活性的表達水平Fig 2 TheexpressionofFoxp3andTLR4proteininTregofeachgroup

2.4 Treg細胞內 NF-κB、p-NF-κB水平 如圖 3所示，與WT Sham相比，WT CLP組小鼠脾臟的Treg細胞內NF-κB和p-NF-κB表達量顯著升高（P＜0.05），與 TLR4-/-Sham 組，TLR4-/-CLP 組 NF-κB和 p-NF-κB 表達量較稍升高（P＜0.05）。而 TLR4-/-CLP組與WT CLP組比較，Treg細胞內NF-κB和p-NF-κB 表達量明顯降低（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠Treg細胞內p-NF-κB、NF-κB蛋白的表達水平Fig 3 The expression of p-NF-κB andNF-κB protein in Treg of each group

3 討論

膿毒癥是嚴重創傷、燒傷、休克、大手術和感染后的嚴重并發癥之一，其病情進展可誘發膿毒癥休克和多器官功能衰竭，是ICU常見的致死原因[5-6]。在膿毒癥發病機制中，早期常表現為過度炎癥反應，隨即機體進入持續的免疫抑制狀態，過度的炎癥反應促使機體出現嚴重的免疫功能障礙，甚至出現免疫麻痹[7]，而因免疫麻痹導致的感染并發癥成為膿毒癥患者臨床死亡的主要原因[8-9]。本實驗采用盲腸結扎穿孔復制膿毒癥模型，與人類膿毒癥特點相似，具有較高的相關性[10]。

TLR4屬于Toll樣受體家族，在多種類型的細胞均可得到表達，是天然免疫系統識別病原微生物的主要受體，不僅可特異性識別革蘭氏陰性菌表面的內毒素（lipopolysaccharide，LPS），還能識別類脂A、熱休克蛋白60（HSP60）、真菌表面的多聚體（GXM）。我們在研究中發現，CLP術后24 h，野生型小鼠脾Treg細胞中TLR4表達顯著升高，且TregFoxp3mRNA及其蛋白表達亦明顯升高，但Treg自身凋亡率顯著減少，提示此時Treg功能及活性顯著增強。而TLR4-/-鼠中，Treg自身凋亡率及Foxp3表達（mRNA和蛋白）未見顯著變化，這表明膿毒癥狀態下Treg功能及活性的變化與TLR4表達密切相關，這與Yang[11]及Huss[12]等的研究結果一致。

本研究進一步對作用機制進行了初步探討。TLR4作為LPS的受體，在膿毒癥時兩者結合，通過MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑通過激活NF-κB[13-19]。NF-κB在幾乎所有類型細胞中均存在表達。有研究表明，在膿毒癥時，阻斷TLR4/NF-κB信號通路炎癥因子水平下降[20-21]。結果表明，CLP后24 h，在野生型鼠中Treg細胞中NF-κB和p-NF-κB表達顯著升高，而TLR4-/-時蛋白表達未見顯著變化，這提示膿毒癥時Treg細胞功能及活性的變化與TLR4/NF-κB信號通路密切相關，但具體分子機制仍有待于進一步研究。在我們的實驗結果中還發現，TLR4-/-CLP 組 Treg細胞 NF-κB、p-NF-κB 蛋白表達量較TLR4-/-Sham組輕度增加，此結果可能與膿毒癥病理過程復雜，多條信號通路參與其發生發展過程有關，擬下一步對該結果進行研究分析。

膿毒癥病理機制極其復雜，涉及多條信號通路及多種作用機制，本研究僅探討其中一條信號通路，且對象為動物模型，尚需進一步研究探索后應用于臨床治療，本研究旨在為臨床治療膿毒癥提供新的方向與理論依據。