乳腺癌他莫昔芬耐藥相關基因及通路的篩選

柴慈曼，楊紹時

（天津醫科大學第二醫院甲狀腺乳腺外科，天津 300211）

根據《2015年中國腫瘤登記年報》，乳腺癌在我國女性惡性腫瘤中高居榜首，占女性癌癥總人數的15%，且發病率逐年遞增，2015年我國新發乳腺癌27.24萬人，死亡7.07萬人[1]。根據乳腺癌分子分型，約70%是雌激素受體（ER）和或孕激素受體（PR）陽性型，腫瘤生長具有雌激素依賴性[2]。對于這類患者，阻斷雌激素相關通路的內分泌治療是經濟、有效、低毒性的治療方法，也是目前國內外乳腺癌診治指南中的標準治療方案，臨床上他莫昔芬作為乳腺癌內分泌治療的經典藥物，在治療過程中常發生耐藥現象，約40%的ER陽性乳腺癌患者初始治療即對他莫昔芬不敏感（即原發性耐藥），另有約25%的患者初始治療有效，長期用藥后出現耐藥（即獲得性耐藥）[3]。目前對于他莫昔芬治療出現耐藥而發生復發轉移的病人并沒有針對性的治療方法。雖然對此問題的研究逐年增多[4-5],但目前仍然缺乏確切有效的治療靶點。本研究利用Gene Expression Omnibus（GEO）公共數據庫提取ER陽性乳腺癌mRNA表達譜芯片測序數據，應用生物信息學方法，篩選ER陽性型乳腺癌患者群體中出現他莫昔芬耐藥的關鍵分子和信號通路，從而深入了解乳腺癌他莫昔芬耐藥的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 從NCBI的基因表達綜合數據庫（gene expression omnibus，GEO）下載獲取乳腺癌他莫昔芬敏感和耐藥細胞系的mRNA表達譜芯片，芯片號GSE26459，提交者為Gonzalez-Malerva L等。mRNA表達譜數據來源于AffymetrixHuman Genome U133 Plus2.0Array實驗平臺，平臺號GPL570，包含和24個樣本（12個MCF7vs12個MCF7TAM），樣本號為GSM649484～GSM649507，樣本分 4 組處理：（1）去雌激素血清（對照組）；（2）雌激素（9～10 mol/L）；（3）他莫昔芬（1 μmol/L）；（4）雌激素+他莫昔芬同時處理。

1.2 生物信息學分析

1.2.1 數據處理與差異表達基因分析 從GEO數據庫中選擇生物芯片GSE26459下載的mRNA表達譜芯片數據集導入到R 3.4.3軟件（https://cran.rproject.org/），其中bioconductor具有強大的生物信息分析處理功能。基于clusterProfiler中的raw實現數據標準化，利用limma篩選出兩組差異表達基因。選擇他莫昔芬耐藥細胞系MCF7TAM與他莫昔芬敏感細胞系MCF7兩組進行t檢驗，以P-value＜0.05并且FDR＜0.1并且Fold Change＞2為標準，篩選他莫昔芬耐藥細胞系MCF7TAM與他莫昔芬敏感細胞系MCF7的mRNA差異表達，利用R軟件中的ggplot2繪制熱圖。

1.2.2 差異基因的Gene Ontology（GO）富集和KEGG通路富集分析 利用基因功能注釋分析工具DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）版本6.8對差異基因中顯著上調和下調的基因進行Gene Ontology富集分析和KEGG通路富集分析(篩選標準:P＜0.01)，發現與ER陽性乳腺癌細胞系中他莫昔芬耐藥潛在的顯著相關生物學過程。

1.2.3 差異基因的相互作用網絡分析 利用STRING（http://string-db.org/）版本 10.5，將獲得的差異基因進行蛋白相互作用網絡分析。獲得中心節點蛋白，及其與其他蛋白的相互作用關系。

1.2.4 GSEA富集分析 利用GSEA軟件（Gene set enrichment analysis，網址 http://gsea.org/）版本 3.0，利用已篩選出的差異基因集，將差異基因按照在兩類樣本（他莫昔芬耐藥細胞系和他莫昔芬敏感細胞系）中的差異表達程度排序，然后檢驗預先設定的基因集合是否在這個排序表的頂端或者底端富集，number of permutations=1 000。

1.2.5 驗證候選目標分子-ACSL1 結合乳腺癌內分泌耐藥中關鍵機制及相關分子篩選出候選目標分子-ACSL1。Western-blotting驗證ER陽性乳腺癌他莫昔芬耐藥細胞中ACSL1的表達變化情況。同時結合CCLE數據庫（https://portals.broadinstitute.org/ccle）在RNA-seq芯片中驗證ACSL1的組織表達情況，在 GEPIA 數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）驗證ACSL1組織表達情況，同時分析乳腺癌患者中ACSL1高表達組和低表達組的生存差異。

2 結果

2.1 數據處理與差異表達基因 分析數據標準化后，對篩選出來的差異基因進行聚類分析繪制熱圖，見圖1。

圖1 他莫昔芬耐藥細胞系MCF7TAM與敏感細胞系MCF7對照共差異基因熱圖Fig 1 Heat map of DEGs expression in tamoxifen-resistance group and tamoxifen-sensitive group

2.2 Gene Ontology富集分析結果和KEGG通路富集結果 GO富集分析結果顯示分子功能富集到輔酶A連接酶的活性、細胞骨架蛋白連接、蛋白酶連接等功能結構域（表1）。KEGG通路富集到PPAR信號通路、細胞粘附因子、脂肪酸代謝信號通路、胰島素抵抗通路、AMPK信號通路、FoxO信號通路等信號通路（表 2）。

表1 Gene Ontology富集分析結果（分子功能）Tab 1 GO categories of DEGs（Molecular Function）

2.3 差異基因的蛋白-蛋白作用網絡 蛋白-蛋白作用網絡結果分析顯示，整個網絡以ACSL1、ACACB、IRS1、TGFB1、COLOA1、CD36、EDN1、TIMP1、TIMP3、LGALS3BP、HIST1H4J、HIST1H2BK、HIST1H2AE、HIST1H2BH、DNAJC12、SLC30A4等蛋白在蛋白作用網絡中心位置，是蛋白作用網絡的關鍵節點（圖2）。

表2 KEGG通路富集結果（前12條）Tab 2Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment analysis

圖2 差異基因對應蛋白相互作用網絡分析Fig 2 Protein-protein interaction network

2.4 GSEA富集結果 GSEA富集分析得到了差異基因富集的通路，其中以脂肪酸代謝通路為代表，ES值為正數，提示基因富集在他莫昔芬耐藥組。在脂肪酸代謝通路中富集的差異基因，其中ACSL1基因在他莫昔芬耐藥組比在敏感組中顯著高表達且差異最顯著（圖3）。

圖3 GSEA富集分析部分結果-脂肪酸代謝通路Fig 3 Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)report-Fatty acid metabolism

GSM649484～GSM649495為他莫昔芬敏感細胞系MCF7，GSM649496～GSM649507為他莫昔芬耐藥細胞系MCF7TAM，通路富集結果為耐藥組vs敏感組

2.5 驗證候選目標分子-ACSL1

2.5.1 western-blotting實驗驗證ACSL1表達 WB實驗結果顯示ACSL1在通過MCF7誘導的他莫昔芬耐藥細胞系（MCF7TAM）中ACSL1蛋白表達顯著高于他莫昔芬敏感的（MCF7）細胞系（圖4）。

2.5.2 數據庫驗證ACSL1組織表達差異和生存差異 在CCLE數據庫和GEPIA數據庫中查找ACSL1在不同組織中表達情況得到了相似的結果，ACSL1在脂肪組織和乳腺組織中均有較高表達。

圖4 WB驗證耐藥細胞系中ACSL1表達變化Fig 4 Western-blotting shows the differences of ACSL1 expression

GEPIA數據庫分析乳腺癌患者中ACSL1高表達組和低表達組的生存曲線（圖5）。發現高表達ACSL1的患者總生存時間有低于ACSL1低表達組的趨勢。ACSL1在他莫昔芬耐藥中表達量顯著變化，提示其可能是他莫昔芬耐藥過程中的重要分子。

圖5 GEPIA數據庫中ACSL1不同表達量情況下的總生存差異Fig 5 Over survival with different expression quantities of ACSL1 in GEPIA database

3 討論

本研究經過乳腺癌他莫昔芬耐藥相關基因及通路的篩選分析發現，差異基因中在脂肪酸代謝相關的生物學過程中顯著富集。這提示耐藥機制中與脂肪酸代謝相關的分子信號通路和生物學過程發生了改變，從而引起耐藥的發生和ER陽性乳腺癌的進展。近年來研究發現肥胖與乳腺癌發生及侵襲轉移有很高的相關性[6]，而這一通路中涉及胰島素抵抗、脂肪酸代謝、糖異生等代謝相關的生物學改變[7]，本研究的分析結果高度提示這些信號通路在他莫昔芬耐藥的過程中也扮演了重要的角色。

本研究篩選出他莫昔芬耐藥乳腺癌中的候選關鍵基因，也是脂肪酸代謝信號通路中的關鍵分子ACSL1。ACSL1屬于長鏈脂肪酸連接酶A家族的同工酶，這個家族的所有同功酶促進游離長鏈脂肪酸轉化為脂肪酰酯，從而在脂質合成和脂肪酸降解中發揮關鍵作用。ACSL有4種類型，包括ACSL1、ACSL2、ACSL3、ACSL4，其中在轉移性乳腺癌中ACSL1表達情況ER陽性型顯著低于其他類型[8]，但是在耐藥細胞系中ACSL1卻明顯異常高表達，提示ACSL1與他莫昔芬耐藥相關。本研究進一步對ACSL1進行了實驗和數據庫的雙重驗證，顯示ACSL1在ER陽性乳腺癌內分泌治療耐藥過程中是候選關鍵基因，ACSL1表達上調參與誘導內分泌耐藥發生，降低患者生存率和生存時間。

本研究富集到了脂肪酸代謝、細胞粘附因子、胰島素抵抗等他莫昔芬耐藥相關分子信號通路。（1）脂肪酸代謝通路可能在他莫昔芬耐藥機制中起了關鍵作用。脂肪酸代謝是細胞生命活動中的重要一環，對于癌細胞生存來說尤為重要，不停生長的癌細胞需要大量脂肪酸來組成它的磷脂膜以及提供能量。脂肪代謝參與腫瘤調控，可能的作用機制最近有新的研究報道，脂肪細胞中的P62蛋白失活會抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，從而促進前列腺腫瘤細胞關閉脂肪組織耗能過程，使得腫瘤細胞吸收脂肪酸和其他能量，加快腫瘤生長和轉移[9]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑已經被應用在很多癌癥的治療上[10]，為新的腫瘤治療靶點提供了理論依據。脂肪酸代謝途徑中關鍵酶-脂肪酸合成酶（Fatty AcidSyntheses，FAS）在乳腺癌細胞比正常乳腺細胞顯著高表達，而FAS拮抗劑則可以抑制腫瘤細胞的生長，同時FAS被認為是乳腺癌復發的可靠預測指標[11-12]。脂肪酸代謝過程受到固醇調節元件結合蛋白（SREBP）調節，它在受到生長因子包括胰島素、表皮生長因子等刺激后，激活FAS、ACSL等脂質合成的靶基因，促進內源脂質的合成，而內源脂質是腫瘤細胞主要脂質來源，從而促進腫瘤生長[13]，也有學者提出生長因子通過Akt-SREBP-FAS信號途徑調節脂質代謝[14]。耐藥過程中很可能發生了脂肪酸代謝通路中關鍵基因的改變，脂肪酸代謝通路被異常激活，促進了乳腺癌細胞增殖或遷移。但該機制尚待進一步驗證。另一個可能的機制是脂肪因子通過激活FoxO信號通路參與內分泌耐藥。已有的研究證實PI3K-AKT-FoxO信號軸是一個雌激素非依賴性乳腺癌進展的關鍵因素。PI3K-AKT途徑的激活,導致FoxO腫瘤抑制功能下調，驅動乳腺癌的增殖[15]。（2）胰島素抵抗途徑通過調控了AMPK信號通路，激活PI3K信號通路，激活c-Jun NH2，從而參與乳腺癌的進展[16]。（3）細胞粘附因子通路與已經發表的實驗結論相符，實驗證實在雌激素抵抗的乳腺癌的內分泌耐藥機制中細胞粘附通路起到重要作用，其中c-src激酶是一個重要節點[17]，非雌激素依賴的乳腺癌中細胞粘附分子如E-鈣粘蛋白表達下調，在細胞間粘附不強的乳腺癌細胞中，src激酶過度活化可以激活多種信號途徑，促進乳腺癌細胞的增殖。

本研究利用生物信息學有效分析他莫昔芬耐藥乳腺癌的基因芯片數據，獲取他莫昔芬耐藥機制的關鍵信息，為篩選重要的分子標志物提供依據。