miR-202、AFP及DKK1在原發性肝癌患者血清中的表達及其意義

韓 悅，魏殿軍

（天津醫科大學第二醫院檢驗科，天津 300211）

原發性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是肝細胞發生的惡性腫瘤，與肝硬化、病毒性肝炎密切相關，目前其病因及發病機制尚不明確。調查發現，PHC發病率較高，在世界惡性腫瘤中處于第5位，死亡率為第2位[1]。在我國，PHC高發于東南沿海地區，是危害人們身心健康的一大殺手。據統計，我國PHC病人的中位年齡為40～50歲，男性多于女性，其死亡率約為98%，略高于PHC全球死亡率，且死亡人數占到肝癌全球死亡人數的一半以上[2]。由于PHC早期癥狀不顯著，患者被確診時已是中晚期，因而錯過了最佳治療時期，即使獲得根治性治療，5年內仍有60%～70%的患者出現復發[3]。PHC病情發展加快會導致患者肝功能衰竭，晚期癌細胞大量增殖，擴散至周圍組織及遠處器官，如門靜脈、肺部、腦部等，惡化程度加劇。及早發現并治療可提高PHC患者的生存率，改善生存質量。本研究通過檢測肝癌患者血清中微小RNA-202（micro RNA-202,miR-202）、甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）、分泌性蛋白 Dikkopf-1（secreted protein,DKK1）的水平，運用ROC曲線分析3個指標聯合檢測診斷PHC的價值，探究提高臨床診斷PHC準確性的方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年6月—2014年12月天津醫科大學第二醫院肝病科收治的43例PHC患者（PHC組）、37例良性肝病患者（良性肝病組）及51例同期健康體檢人員（健康對照組）。根據原發性肝癌規范化病理診斷指南（2015年版）[4]對PHC進行診斷，并經病理檢查確診為PHC。PHC組男性25例，女性18例，年齡29～76歲，平均年齡（54.2±4.9）歲；良性肝病患者男性22例，女性15例，年齡32～77歲，平均年齡（53.9±6.1）歲，其中肝囊腫18例，肝血管瘤19例；健康對照組男性29例，女性22例，年齡30～81 歲，平均年齡（56.2±8.3）歲。納入標準：（1）患者初次確診；（2）之前未接受任何治療。排除標準：（1）合并神經性疾病或語言交流障礙者；（2）妊娠或哺乳期婦女；（3）有其他惡性腫瘤疾病患者；（4）有自身免疫性疾病患者；（5）藥物性肝病或病毒性肝病患者；（6）臨床依從性較差患者。3組受試對象在性別（χ2=0.060，P=0.971）、年齡（F=1.590，P=0.207）上比較，差異無統計學意義，具有可比性（P＞0.05）。本研究經天津醫科大學第二醫院醫學倫理委員會批準，所有受試者均知曉本次研究并簽署知情同意書。

1.2 方法 分別采集3組受試對象清晨空腹靜脈血 10mL，3500r/min 離心 10min，分離血清，于-80℃保存。采用實時熒光定量PCR法（qPCR法）檢測3組受試者血清miR-202含量，先提取血清總RNA，加入引物后，根據逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。分別在95℃、95℃、60℃預變性30 s、3 s、30 s，共40個循環，miR-202的相對表達量以2-△△Ct表示。用實時熒光定量PCR儀擴增定量，用PCR檢測試劑盒進行定量檢測；采用電化學發光法檢測血清中AFP水平；采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清中DKK1水平。所有操作均嚴格按照產品說明書要求進行。

1.3 實驗儀器與試劑盒 總miRNA提取試劑盒、miRNAs逆轉錄試劑盒、miR-202引物（5′-GCTGGAG AGGTATAGGGCA-3′，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′）、內參（5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′） 及探針和miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒（賽默飛世爾）；滅酶EP管（上海俊晟生物科技有限公司）；干浴鍋（上海汗諾儀器有限公司）；實時熒光定量PCR儀（達安基因）；紫外可見分光光度儀（菲勒儀器有限公司）；AFP試劑盒、DKK1試劑盒（武漢明德生物）。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件處理本實驗研究數據，計量數據不服從正態分布，則用中位數和四分位數間距M（Q1，Q3）表示，3組間數據比較采用Kruskal-WallisH檢驗；運用受試者工作特征曲線（ROC 曲線）分析 miR-202、AFP、DKK1及聯合檢測診斷PHC的診斷效能；采用Pearson相關分析研究miR-202、AFP及DKK1的相關性。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-202、AFP及DKK1在PHC組、良性肝病組及健康對照組血清中的表達 PHC組患者血清中miR-202水平低于良性肝病組和健康對照組，有顯著性差異（P＜0.05）；AFP和DKK1水平均高于良性肝病組和健康對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組受試對象血清中miR-202、AFP和DKK1表達水平比較（x±s）Tab 1 Comparison of the levels of miR-202,AFP and DKK1 expression in the serum of the three groups（x±s）

2.2 血清miR-202、AFP及DKK1診斷PHC的效能 聯合檢測診斷PHC的效能高于miR-202、AFP及DKK1單獨檢測，且聯合檢測的ROC曲線下面積最大，為0.917。ROC曲線下面積比較，AUC聯合檢測＞AUCmiR-202（Z=2.075，P＜0.05），差異具有統計學意義；AUC聯合檢測＞AUCAFP，AUC聯合檢測＞AUCDKK1，差異無統計學意義（Z值分別為 1.812，1.202，P均＞0.05）；AUCmiR-202＜AUCAFP，AUCmiR-202＜AUCDKK1，差異無統計學意義 （Z值分別為-0.743，-1.261，P均＞0.05）；AUCAFP＜ AUCDKK1，P＞0.05。詳見圖 1、表 2 和表 3。

圖1 miR-202、AFP、DKK1及聯合檢測診斷PHC的ROC曲線Fig 1 Thereceiveroperatingcharacteristiccurves(ROC)formiR-202,AFP,DKK1 and combined detection for the diagnosis of PHC

圖2 miR-202、AFP及DKK1的相關性Fig 2 Correlation between miR-202,AFP and DKK1

2.3 miR-202、AFP及DKK1的相關性分析 miR-202與 AFP 呈負相關（r=-0.314，P=0.005）；miR-202與 DKK1 呈負相關 （r=-0.319，P=0.004）；AFP 與DKK1 呈正相關（r=0.556，P＜0.001）。

表2 聯合檢測miR-202、AFP及DKK1對PHC的診斷價值（%）Tab 2 The diagnostic value of combined detection of mir-202,AFP and DKK1 for PHC(%)

表3 miR-202、AFP、DKK1及聯合檢測診斷PHC的ROC曲線下面積Tab 3 Area under the receiver operating characteristic curves(ROC)for miR-202,AFP,DKK1 and combined detection for the diagnosis of PHC

3 討論

PHC的發生發展是多種因素參與、分階段進行的過程，早期不易發現，僅有少部分患者經確診后可以治療，因而造成PHC患者預后不良。目前，臨床診斷PHC仍以影像學檢查和肝組織活檢病理檢查為主，然而兩者均有不足之處。CT、MRI聯合檢測及B超篩查對患者無創傷，但其判斷誤差較大，需具備良好生理解剖知識及豐富影像學鑒定經驗的醫師來完成[5]；肝組織活檢的準確性相對較高，但易給患者帶來創傷、出血風險，臨床上應用受到限制[6]。可見，PHC傳統的診斷方法存在局限，尋找腫瘤細胞篩查的新途徑顯得尤為重要。研究發現，血清學標志物水平檢測近年應用較為廣泛[7]。

有研究報道，多種miRNAs在肝癌組織中存在異常表達，在眾多miRNAs中，miR-202位于10q26的脆性位點，與大腦腫瘤、子宮內膜存在密切關聯[8-9]。報道指出，miR-202在多種疾病中表達存在異常（如食管癌、胃癌），但關于其在肝癌中表達的報道較少[10]。本研究中，PHC患者血清中miR-202水平顯著低于良性肝病組和健康對照組，這與Zhang等[10]的研究結果基本一致，說明miR-202在肝癌發展過程中起到抑制癌基因的作用。Fu等[11]研究發現，血清中的miRNA穩定性較好，難以被降解，且其具備一定的組織特異性，因此miRNA-202可以作為潛在的生物標記物對PHC進行診斷。本研究結果顯示，miRNA-202單項診斷PHC的準確性為73.75%，說明僅憑miRNA-202診斷PHC易造成誤診和漏診。

AFP為臨床上常用的肝癌標志物，AFP在正常成人血清中含量極微，但有報道指出，約有50%～60%的PHC患者AFP表達升高，且AFP在肝炎及肝硬化患者中也有不同程度的升高[12]。本研究中PHC患者AFP水平高于良性肝病患者健康受試者，此結果與上述研究一致。血清AFP診斷PHC的敏感度為69.77%，特異性為70.27%，結果與Sakr等[13]研究結果類似。另外，AFP診斷PHC的ROC曲線下面積相比較而言不是很高，可能原因是癌變時的肝細胞受到低甲基化干擾，從而使其合成的AFP表達處于開放化狀態，提示單獨應用AFP診斷PHC存在一定的誤診及漏診率。

DKK1是由266個氨基酸組成的一種分泌型糖蛋白，其能與相應的受體結合并調控細胞的分化、增殖、凋亡及遷移，在腫瘤發生方面具有重要作用。研究指出，DKK1在乳腺癌、胃癌等中表達水平降低，而在肝癌、肺癌中的表達升高。本研究發現，與良性肝病組和健康對照組相比，PHC組患者血清中DKK1水平升高，提示DKK1可用于PHC的診斷。DKK1對PHC診斷的敏感度為83.72%，特異性83.78%，結果與既往研究存在差異[14]。由于單項腫瘤標志物診斷PHC的敏感度及特異性均難滿足臨床早期診斷及預后評估的要求，所以在實際工作中推薦應用聯合檢測。AFP、miRNA-202、DKK1 3項指標聯合檢測診斷PHC的AUC提升至0.917，高于AFP、miRNA-202、DKK1單獨檢測。因此認為三者聯合檢測在PHC診斷方面更具優勢[15]。此外，3個指標相關性分析發現，miR-202與AFP、DKK1均呈正相關，AFP與DKK1呈正相關，提示三者血清水平存在聯系。

綜上所述，miR-202、AFP及DKK1聯合檢測可以提高PHC診斷的準確性，為臨床診治PHC提供參考依據。然而本研究樣本量小，后續將擴大樣本量并進一步探究3個指標在PHC中的作用機制。