通腑瀉肺法對ALI/ARDS大鼠腸屏障的保護作用*

蘇景深，劉恩順，孫增濤，鄭 莉，趙鑫民，陳善夫

（1.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300150；2.天津市津南區咸水沽醫院，天津 300073；3.天津中醫藥大學，天津 300193）

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）作為一種臨床危重癥幾乎涉及各個學科，腸道屏障功能在ALI/ARDS發病過程中起的作用越來越受到人們重視。腸道不僅是諸多危重疾病的靶器官，更是啟動者，腸道屏障功能已成為判斷危重患者預后的一個重要指標[1-2]。中醫從“肺與大腸相表里”理論出發，運用通腑瀉肺方法治療肺系膿毒血癥在臨床上取得了較好的療效[3]。前期研究發現，通腑瀉肺中藥能夠降低血清細胞因子水平，減輕肺組織和全身的炎癥損傷[4]。為此，筆者用脂多糖（LPS）復制大鼠ALI/ARDS模型，用通腑瀉肺中藥進行干預，探討其對ALI/ARDS大鼠腸屏障的影響。

1 材料

1.1 動物 健康SD大鼠27只，雄性，體質量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（許可證號：SCXX（京）2012－0001），購入后置中國醫學科學院生物醫學工程研究所實驗中心常規飼養。

1.2 藥物及試劑 通腑瀉肺中藥顆粒劑 (葶藶子、桑白皮、大黃、枳實、厚樸)，購自天津中醫藥大學第二附屬醫院藥房。通腑瀉肺方用蒸餾水配置，4℃冰箱保存備用。大腸桿菌內毒素脂多糖（美國，S igma公司）。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 儀器 去離子水儀，PALL,Purelab Plu。高速離心機，Centrifuge 5415D，Eppendorf公司。分光光度計，NANODROP 2000，Therno scientific。渦旋振蕩儀，QL-902，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。轉移脫色搖床，TS-8，海門其林貝爾儀器制造公司。

2 方法

2.1 ALI/ARDS模型的建立及分組給藥 動物購入后適應性飼養1周，將大鼠按隨機數字隨機分為空白對照組、模型組、中藥組，每組9只。模型組與中藥組于左側尾靜脈注射內毒素8 mg/kg，復制ALI/ARDS模型。正常對照組大鼠靜脈注射生理鹽水。對照組與模型組在造模完成后即用生理鹽水灌服，每次0.01 mL/g。治療組在造模完成后給予通腑瀉肺中藥灌胃，每次0.01 mL/g，每日1次，共7日。

2.2 鏡下觀察 給藥1周后，截取距幽門下15 cm處腸組織，10%甲醛溶液固定，常規石蠟切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色檢測。光鏡下觀察，比較分析各組大鼠腸組織病理學改變。

2.3 酶聯免疫吸附反應（ELISA）法檢測大鼠血血漿D-乳酸及DAO水平 于大鼠腹主動脈取血，離心后進行ELISA實驗，分別測定血漿中漿D-乳酸、DAO的表達情況。操作步驟按參照試劑盒說明書進行。將檢測結果用ELISA標準曲線專用軟件分別作出漿D-乳酸、DAO濃度的標準曲線，分別用標準曲線計算出各檢測孔中漿D-乳酸及DAO的濃度。

2.4 免疫組化染色方法檢測檢測腸組織NF-κB P65及TLR4蛋白的表達 將組織切片行脫蠟、水化處理后，高壓修復抗原，用3%過氧化氫溶液消除內源性過氧化酶，血清封閉后各組切片分別加入兔源性核轉錄因子-κB（NF-κB）P65 及 TLR4 多克隆抗體（均為1∶100稀釋），4℃過夜后加入兔二抗，經二氨基聯苯胺蘭（DAB）顯色，光鏡下觀察。NF-κB P65及TLR4的陽性反應產物均呈棕黃色。光學顯微鏡下隨機觀察5個視野、拍照，代表該動物肺組織蛋白表達強度。應用Image-Pro Plus6.0軟件分析陽性細胞數，同時將空白組陽性細胞率設置為100%，計算其他組別的陽性細胞率，并對結果進行統計分析。

2.5 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件包進行統計分析。數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠腸組織病理情況 空白組大鼠腸組織光鏡下可見腸絨毛排列整齊，上皮完整，絨毛局部輕度變矮、增粗，細胞結構正常；部分黏膜下層水腫，部分固有層輕度水腫，部分黏膜層與肌層輕度分離。模型組大鼠腸組織可見腸絨毛局部上皮脫失，絨毛變矮、增粗、融合；黏膜下層廣泛水腫，血管增生、較多炎細胞浸潤，可見孤立淋巴小結；固有層較多淋巴細胞為主的炎細胞浸潤；黏膜層與肌層廣泛分離。中藥組大鼠腸組織光鏡下可見腸黏膜上皮完整，大部分上皮平坦，局部絨毛變矮、增粗，細胞結構正常；黏膜下層輕度水腫，部分固有層輕度水腫，少量淋巴細胞浸潤；部分黏膜層與肌層輕度分離，見圖1。

3.2 大鼠血漿D-乳酸及DAO水平 與空白組相比，模型組可見大鼠血漿D-乳酸、DAO含量顯著升高（P<0.05）。與模型組相比,治療組血漿D－乳酸、DAO含量明顯降低（P<0.05），見表1。

3.3 腸組織NF-κBP65及TLR4的表達 與空白組比較，模型組可見NF-κB P65表達顯著升高（P<0.05）；中藥組經過治療干預后，NF-κBP65表達下降，差異具有統計學意義（P<0.05）。與空白組比較，模型組可見TLR4表達增強，差異有統計學意義（P<0.05）；中藥組經過治療干預后，TLR4表達顯著下降，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖2、圖3、表2。

表1 各組大鼠血漿D-乳酸、DAO檢測結果比較（±s）Tab.1 Comparison of test resultsof D-lactateand DAO in plasma of ratsin each group（±s）ng/mL

表1 各組大鼠血漿D-乳酸、DAO檢測結果比較（±s）Tab.1 Comparison of test resultsof D-lactateand DAO in plasma of ratsin each group（±s）ng/mL

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別 例數 D-乳酸 DAO空白組 9 1210.3±85.4 494.6±98.8模型組 9 2221.0±69.6* 1 208.2±77.5*中藥組 9 1502.9±96.0* 847.2±49.6#

表2 腸組織表達NF-κB P65及TLR4的平均光密度值（±s）Tab.2 Average density of NF-κB P65 and TLR4 expressed in intestinal tissue（±s）

表2 腸組織表達NF-κB P65及TLR4的平均光密度值（±s）Tab.2 Average density of NF-κB P65 and TLR4 expressed in intestinal tissue（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別 例數 NF-κb P65 TLR4空白組 9 18.056±1.72 14.38±2.08模型組 9 27.526±2.58* 22.01±2.31*中藥組 9 22.009±1.56# 18.627±2.06*

4 討論

長期以來，人們對腸道功能的認識偏重于腸道對營養物質的消化吸收。對危重患者通常認為胃腸功能處于休眠狀態，忽略了胃腸功能在患者整體病理生理過程中的作用。20世紀60年代，Ravin等首先提出胃腸道是發生多器官功能衰竭前無明確感染灶的病人發生膿毒癥的潛在致病源。20世紀80年代Border等進一步提出腸源膿毒血癥（Gos）的概念。1988年Wilmore等提出了“腸道發病的中心器官”學說，腸道屏障功能已引起了人們廣泛而密切的關注。ALI/ARDS狀態下，炎癥介質大量產生并相互作用,形成網絡，且不斷循環促進，形成“瀑布樣”反應,造成腸黏膜損傷加重甚至衰竭，腸道的屏障功能受到削弱或損害,可使大量的細菌和內毒素經過門靜脈和腸黏膜淋巴系統侵入循環，造成腸源性內毒素血癥和菌群移位，并在一定條件下激發細胞因子和其他炎癥介質的連鎖反應,引起全身器官的損害[5]。已有許多研究證明腸道在全身炎癥反應綜合征（SIRS）、膿毒癥、MODS的連續發生發展中起重要作用[6-7]。有研究發現膿毒癥引起的肺、腸和腎的上皮功能紊亂，屏障功能和離子運輸功能受到影響，從而發生器官功能障礙，造成死亡[8]。研究表明選擇性腸道去污能抑制SIRS患者內毒素和炎癥介質的釋放，并能起到較好的保護作用，其機制可能與保護腸黏膜屏障功能有關[9]。

圖1 各組大鼠腸組織病理結果Fig.1 Intestinal histopathology resultsof ratsin each group

圖2 NF-κB P65在腸組織的表達Fig.2 Expression of NF-κB P65 in the intestinal tissue

圖3 TLR4在腸組織的表達Fig.3 Expression of TLR4 in the intestinal tissue

根據ALI/ARDS臨床表現的呼吸窘迫、發紺、便秘、腹滿等特點，傳統醫學從“肺與大腸相表里”這一體現臟腑相關的整體觀的理論出發，將ALI/ARDS病機特點概括為肺腸同病，治療當以通腑瀉肺為法。通腑瀉肺中藥由大黃、枳實、厚樸、葶藶子、桑白皮組成。方中大黃、厚樸、枳實，可以輕下熱結，除滿消痞。葶藶子、桑白皮瀉肺平喘，行水消腫。全方藥簡力專，既能瀉肺平喘，又能通腑瀉熱，肺腸同治。研究發現大黃和早期腸內營養支持治療能改善大鼠腸缺血-再灌注損傷后腸黏膜屏障的影響，減輕血清內毒素血癥和細菌易位[10]。藥理研究證實[11]大黃能夠改善腸黏膜血流灌注，改善腸黏膜缺血缺氧狀態，促進胃腸蠕動恢復,保護胃腸黏膜屏障。桑白皮丙酮提取物能夠使豚鼠腸系膜毛細血管交叉數目明顯增加，改善血流狀態，增加血流速度。

本實驗結果發現，模型組大鼠腸組織病理可見腸絨毛變矮、增粗融合，黏膜下層廣泛水腫，炎細胞浸潤，固有層較多淋巴細胞為主的炎細胞浸潤；黏膜層與肌層廣泛分離。通腑瀉肺中藥干預后的大鼠腸組織病理損傷減輕。模型組大鼠血漿D-乳酸、DAO明顯升高，提示模型組大鼠腸黏膜受到損傷，其通透性增高，腸組織細胞受損壞死釋放大量DAO入血，血漿DAO活性增高。通腑瀉肺中藥干預后可降低血漿D-乳酸和DAO，提示運用通腑瀉肺法可以減輕ALI/ARDS模型大鼠腸黏膜損傷，對腸屏障具有保護作用。模型組大鼠腸組織NF-κB P65、TLR4蛋白表達升高，通腑瀉肺中藥干預后其表達顯著降低，提示通腑瀉肺中藥可以抑制TLR4、NF-κB介導的炎癥反應，降低炎癥反應程度。本實驗發現通腑瀉肺中藥對ALI/ARDS病理過程中釋放的大量炎性細胞因子有抑制作用，改善ALI/ARDS時腸黏膜的缺血缺氧狀態，增加腸黏膜血流灌注，減輕腸黏膜細胞損害，降低腸黏膜通透性，對腸黏膜屏障起到保護作用。但是其作用機制復雜，靶點眾多，需要進一步深入探索。