葛根素通過Nrf2/ARE通路調控小神經膠質BV-2細胞的氧化應激損傷

李 兵，張 嬋，林 芳，李自明，周 劍

（華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院藥學部，武漢 430030）

帕金森病多常見于老年人，屬于一種神經退行性功能障礙病變，臨床病癥主要為震顫麻痹，病理特征表現在多巴胺能神經元損傷[1]。早期研究表明機體受到氧化應激刺激時，機體氧化/抗氧化系統失衡，抗氧化能力減弱，導致自由基過得堆積，引起機體的嚴重損傷。其中活性氧（ROS）是氧化應激損傷的主要產物之一，并且在帕金森病發生發展中起著重要的作用[2]。發現核轉錄因子（Nrf2）可以通過介導抗氧化反應元件（AER）活性來調節氧化應激途徑[3]。于是，探討Nrf2/AER信號通路的調控作用對帕金森病的發病機制的研究具有重大意義。早期也有研究發現葛根素對6-羥多巴胺所致帕金森病大鼠具有保護作用[4]，而且葛根素還可通過Nrf2/ARE信號通路抵抗氧化應激對創傷性腦損傷的神經保護[5]。因此，本文旨在研究葛根素對BV-2細胞氧化應激損傷的保護作用，并對其可能調控Nrf2/ARE信號通路活化這一機制進行探討。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑 小神經膠質BV-2細胞購買于南京科默生物細胞庫；葛根素（武漢遠成共創科技有限公司，純度 98%，批號：23521-698-23）；CCK8試劑盒（上海威奧生物科技有限公司，批號：CJ-150-25）；丙二醛（MDA）試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司，批號：SHP-1230-24）；一氧化氮（NO）試劑盒（江蘇澤雨生物科技有限公司，批號：HTC-4203-54）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（北京默沙克生物科技有限公司，批號：SJ-1540-93）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司，批號：C15740）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司，批號：20170512）；RPMI 1640培養基（Gibco公司，批號：RT-1630-21）；βactin、HO-1、SOD1、Jak2、p-Jak2、State3 及 p-State3一抗均購自美國Sigma公司；對應二抗購自武漢谷歌生物有限公司。

1.2 儀器 酶標儀（南京德鐵儀器公司，型號：HBS-1096A）；單人超凈臺（濟南鑫貝西生物技術有限公司，型號：BBS-V800）；細胞培養箱（上海旦鼎國際貿易有限公司，型號：SANYO）；雙色紅外激光成像系統（美國 BIO-RAD，批號：LI-COR ODYSSEY）。

1.3 BV-2細胞培養 將單人超凈工作臺及相關實驗物品紫外光照消毒30 min，復蘇BV-2細胞進行傳代培養，1640完全培養基（10%胎牛血清，1%的100 U/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素）于37℃、5%CO2培養箱中培養，每隔2 d換液1次，培養3～4 d進行傳代培養，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.4 細胞存活率實驗 取對數期細胞進行消化、離心、重懸、計數后，取適量細胞數接種于96孔板中，培養過夜，分為空白對照組、H2O2誘導模型組、H2O2+5μmol/L葛根素組、H2O2+10μmol/L葛根素組、H2O2+20μmol/L葛根素組，培養24 h后吸干舊培養基，每孔加入100μL含10μL CCK8試劑的完全培養基，繼續于37℃、5%CO2培養箱中孵育1 h，然后在波長450 nm處的酶標儀中測定每孔吸光度值。

1.5 細胞勻漿MDA、NO及SOD檢測 取對數期細胞進行消化、離心、重懸、計數后，取適量細胞數接種于6孔板中，培養過夜，分為空白對照組、H2O2誘導模型組、H2O2+5μmol/L葛根素組、H2O2+10μmol/L葛根素組、H2O2+20μmol/L葛根素組，于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，收集細胞制備成勻漿，按照試劑盒操作說明書進行MDA、NO水平及SOD活性檢測。

1.6 免疫印跡檢測蛋白水平 取對數期細胞進行消化、離心、重懸、計數后，取適量細胞數接種于6孔板中，培養過夜，分為空白對照組、H2O2誘導模型組、H2O2+5μmol/L葛根素組、H2O2+10μmol/L葛根素組、H2O2+20μmol/L葛根素組，于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，收集細胞、裂解、離心、收集上清、檢測蛋白濃度。然后每孔上樣量50μg，進行電泳分析、轉膜、封閉、孵育一抗過夜、洗膜、孵育二抗、洗膜及蛋白表達分析。

1.7 統計學分析 采用SPSS20．0軟件進行統計分析，實驗數據用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析檢驗，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05具有統計學意義。

2 結果

2.1 葛根素對BV-2細胞存活率的影響 采用CCK8試劑盒分析了葛根素對BV-2細胞存活率的影響，結果如表1所示。結果顯示：單純的H2O2刺激可明顯降低細胞的存活率，相對于正常對照組差異有統計學意義（P＜0．05）；而經過不同劑量葛根素干預24 h后，可見葛根素可明顯提高細胞的存活率，并隨著藥物劑量升高細胞的相對存活率升高的越明顯，表現出濃度依賴性，并且各藥物組與H2O2誘導組之間差異均有統計學意義（P＜0．05），藥物組兩兩之間的比較差異也有統計學意義（P＜0．05）。

表1 不同組間BV-2細胞存活率的比較（n=6）Tab.1 Comparison of the survival ratesof BV-2 cellsin different group(n=6)

2.2 葛根素對BV-2細胞氧化應激產物的影響 相關試劑盒分析了葛根素對BV-2細胞氧化應激產物含量的影響，結果見表2。結果顯示：單純的H2O2干預可明顯誘導MDA、NO的釋放及降低SOD的活性，相對于正常對照組差異有統計學意義（P＜0．05）；經過不同濃度葛根素干預后，勻漿中 MDA、NO的水平顯著減少，而SOD酶活性則明顯升高，與H2O2誘導組相比差異均有統計學意義（P＜0．05），并且隨著葛根素劑量的升高，3種指標與H2O2誘導組之間的差異越顯著，表現出濃度依賴性。

表2 不同組別間細胞氧化應激產物的比較（n=6）Tab.2 Comparision of oxidativestressparametersin cells among the groups（n=6）

2.3 葛根素對Nrf2活化與轉位的影響 H2O2干預組BV-2細胞中細胞核內Nrf2的表達顯著低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0．05）。隨著不同劑量的葛根素干預后，胞核內Nrf2的表達顯著升高，與 H2O2干預組相比差異均有統計學意義（P＜0．05）。如圖1所示。

2.4 葛根素對織Nrf2下游靶基因GCLC、NQO1和HO-1蛋白表達的影響 H2O2干預組BV-2細胞中GCLC、NQO1和HO-1蛋白的表達顯著低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0．05）。隨著不同劑量的葛根素干預后，細胞中GCLC、NQO1和HO-1蛋白的表達顯著升高，與H2O2干預組相比差異均有統計學意義（P<0.05）。如圖2所示。

圖1 葛根素對Nrf2核轉位的影響（n=6）Fig.1 Effect of puerarin on Nrf2 translocation in the BV-2 cell(n=6)

圖2 葛根素對GCLC、NQO1和HO-1蛋白的影響（n=6）Fig.2 Effect of puerarin on theexpression of GCLC,NQO1 and HO-1 in the BV-2 cell(n=6)

3 討論

當前有關研究顯示，葛根素具有廣泛的藥理作用，如在治療高脂血癥、糖尿病、老年性癡呆、心臟缺血再灌注損傷等疾病都表現出良好的療效[6]，并且其針對不同的疾病治療機制也各不相同。在葛根素改善心臟缺血/再灌注損傷過程中，主要通過誘導PI3K/AKT信號通路活化進一步上調eNOS基因表達來實現。氧化應激屬于大量自由基堆積引發的損傷，引起機體氧化/抗氧化系統失衡，而且氧化應激還是導致衰老和病態的一個重要原因[7]。誘導抗氧化因子間協調作用能夠幫助恢復抗氧化系統功能，從而有效的對抗氧化應激損傷。H2O2是誘導氧化應激損傷的良好誘導劑，雖然小神經膠質細胞是大腦的神經性免疫細胞，對炎性因子比較敏感，并且還能夠進一步誘導氧化應激損傷。然而，文章主要探討葛根素對BV-2細胞氧化應激損傷的影響，采用H2O2誘導的氧化應激模型比較單一，可以降低其他炎性反應的影響。文章采用H2O2誘導BV-2細胞氧化應激損傷模型，發現H2O2誘導組細胞產生的氧化應激產物MDA及NO顯著升高，抗氧化酶SOD活性顯著降低，說明氧化應激損傷模型構建成功。經過不同濃度葛根素干預損傷細胞后發現，不同劑量的葛根素可明顯增加細胞的存活率、降低氧化應激產物MDA及NO的釋放及增強SOD酶活性，提示葛根素對氧化應激損傷的BV-2細胞具有較好的保護作用。

前期研究證實葛根素能夠促進腦組織內源性抗氧化劑活性，達到清除腦組織堆積的自由基，緩解氧化應激損傷，改善神經元的損傷[8-9]。但葛根素作用的具體機制尚不是很清楚，已有研究說明人體內多種抗氧化酶均含有一個相同的啟動子序列，即抗氧化反應元件（ARE）[10]。其中轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2）與ARE結合在抗氧化應激損傷中發揮著關鍵性作用。Nrf2/ARE信號通路為細胞內作用的抗氧化防御機制，即當機體受到受到外界刺激時發生細胞內氧化還原狀態的變化，其中Nrf2能磷酸化進而與Keap1解偶聯，進入細胞核，進而與相關基因的ARE序列結合編碼靶基因的轉錄[11]。本文研究發現葛根素可明顯增強Nrf2的轉位，并誘導其下游靶基因GCLC、NQO1及HO-1蛋白的表達。綜上所述，葛根素可明顯降低BV-2細胞的氧化應激損傷，其作用機制可能與Nrf2/ARE信號通路的活化有關。