卵黃高磷蛋白對殼聚糖膜基質(zhì)上MC3T3-E1細胞增殖的影響

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(華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,蛋品加工技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,湖北武漢 430070)

禽蛋是人們獲取營養(yǎng)的重要來源之一,其中富含多種多樣的功能性蛋白。卵黃高磷蛋白(posvitin,PV)就是從禽蛋中提取的磷酸化程度最高的糖蛋白,它占禽蛋總蛋白的7%,含有的磷元素卻高達10%[1-3]。據(jù)報道,PV中絲氨酸占所有氨基酸的30%～50%,其磷酸化程度高達90%[4-6]。這種獨特的高磷酸化結(jié)構使該蛋白在雞胚的骨骼發(fā)育中發(fā)揮了重要作用[7]。體外研究表明，PV還具有很強的金屬離子結(jié)合能力[8]和抗氧化活性[9]等功能。目前國內(nèi)外對PV的研究主要集中在卵黃高磷蛋白乳化性及抗氧化活性、酶解多肽的提取[10]多肽對金屬離子的結(jié)合[11]等方面。實驗室前期一系列研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),PV具有調(diào)控、誘導Ca2+體外礦化的功能,為PV作為一種骨骼發(fā)育營養(yǎng)助劑的高值化應用提供了新方向[12]。目前,關于卵黃高磷蛋白對成骨細胞的增殖分化的影響的報道多集中于細胞增殖和誘導分化[13]。而以生物大分子作載體,研究卵黃高磷蛋白對成骨細胞增殖分化還處于起步階段。

近年來,由于大眾環(huán)保和安全意識的提升,研究者們將更多的目光集中在生物高分子材料上,利用它們安全、無毒、易降解的性質(zhì)做成各種復合膜應用于食品包裝和醫(yī)學、生物等方面[14],比如經(jīng)過脫乙酰過程加工后的甲殼素產(chǎn)物──殼聚糖(Chitosan,CS)。殼聚糖是由β-(1,4)-2-氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖構成線性,而且是自然界中目前發(fā)現(xiàn)的唯一堿性多糖[15-18]。CS本身是一種弱陽離子絮凝劑,因此常用作食品加工中的果汁澄清劑、糖汁絮凝劑[19];此外,CS還可以作為膳食纖維應用于食品添加劑中調(diào)節(jié)人體免疫[20]。CS有很強的成膜能力且安全無毒,因此殼聚糖在食品包裝方面應用普遍[21]。據(jù)研究報道,神經(jīng)干細胞在CS膜上經(jīng)過短期培養(yǎng),其貼附效果比在明膠和PLGA膜上更好[22]。表明CS作為新型負載基質(zhì),在細胞水平上也表現(xiàn)出很好的生物相容性。

本次研究擬制備氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)復合CS膜,以提高CS膜的抗水溶性和負載量。通過檢測MC3T3-E1細胞的細胞活性、細胞凋亡和細胞周期的變化,探討MC3T3-E1細胞在該復合膜上的生理活動,從而研究不同濃度PV對MC3T3-E1細胞的細胞活性和細胞凋亡的影響。以期為后續(xù)為進一步發(fā)展PV成為一種促進人體骨骼發(fā)育的新型材料和營養(yǎng)強化劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮雞蛋 武漢九峰山養(yǎng)雞場;小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14(MC3T3-E1) 中國科學院上海細胞庫;胎牛血清、0.25%胰酶EDTA 澳洲GIBCO公司;α-MEM培養(yǎng)基 美國HyClone公司;抗壞血酸 美國SIGMA公司;β-甘油磷酸鈉 阿拉丁公司;CCK-8試劑盒、Annexin V/PI試劑盒 北京莊盟國際生物基因科技有限公司;細胞周期檢測試劑盒 南京凱基生物；1-(3-甲基氨基醛)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-N-羥基琥珀酰亞胺(NHs) 國藥集團化學試劑有限公司。

HERAcell 1501二氧化碳培養(yǎng)箱 德國Thermo Scientific 公司;IX71熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司;iMark酶標儀 聯(lián)想生物科技有限公司;FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司;TDL-50B臺式低速離心機 上海安亭科學儀器廠;FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司;Option S7超純水系統(tǒng) ELGA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 卵黃高磷蛋白的分離純化 參照張曉維[12]的方法提取卵黃高磷蛋白。用分蛋器分離雞蛋清和蛋黃,隨后將蛋黃放在濾紙上,翻滾來去掉多余的系帶和蛋清,用竹簽刺破蛋黃膜,用冰水浴中的燒杯將流出的蛋黃液收集起來。加入與蛋黃液同等質(zhì)量的蒸餾水混合,用磁力攪拌器攪拌1 h后,再用12000×g離心力離心10 min,隨后收集下層沉淀。再然后用同等質(zhì)量的0.17 mol/L的NaCl溶液與下層沉淀混合攪拌1 h再在12000×g下離心10 min,這樣使蛋黃顆粒(下層沉淀)與蛋黃漿質(zhì)(上清)分離,收集目標物蛋黃顆粒沉淀。用10倍質(zhì)量體積比(g/mL)的1.74 mol/L NaCl溶液和蛋黃顆粒沉淀攪拌混勻,再將溶液的pH調(diào)至4.0,加入聚乙二醇(PEG 6000)使其最終的質(zhì)量比達到3%,攪拌1 h后1200×g下離心10 min獲得上清液。上清液經(jīng)過8000～14000 kDa的透析袋透析后，再次12000×g下離心10 min,收集上清液進行冷凍干燥,即可獲得粗提卵黃高磷蛋白。粗提卵黃高磷蛋白經(jīng)過弱陰離子交換柱得到不含二或三價金屬離子的卵黃高磷蛋白[12]。對層析后的蛋白透析后冷凍干燥即得到不含多價金屬離子和鹽的卵黃高磷蛋白。

1.2.2 卵黃高磷蛋白的純度鑒定 本研究采用的是SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒進行。選用12%濃度的分離膠和5%濃度的濃縮膠。固體樣品用蒸餾水溶解后配制為2 mg/mL的溶液,從中取40 μL蛋白樣液,與10 μL的5×蛋白上樣緩沖液混勻,水浴煮沸4 min,上樣量為10 μL。分離膠電壓為120 V,濃縮膠電壓為80 V。預染色蛋白質(zhì)Marker分子量范圍為10～170 kDa。電泳完成后,電泳凝膠先在固定液中固定40 min;然后轉(zhuǎn)移至磷蛋白染色液1中,在45 ℃水浴搖床中染色40 min;接著轉(zhuǎn)移至磷蛋白染色液2中,在相同溫度下繼續(xù)染色40 min。最后將凝膠浸泡在脫色液中進行脫色,每隔一段時間更換脫色液至背景顏色變?yōu)闊o色為止。最后用凝膠成像儀拍攝電泳結(jié)果。

1.2.3 MC3T3-E1細胞的培養(yǎng)及CS和GO/CS膜的制備 迅速解凍凍存的MC3T3-E1細胞,隨后將細胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中在1200×g下離心2 min后倒上清,再加入適量培養(yǎng)基小心吹打均勻。隨后將細胞懸濁液轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)板上,補充培養(yǎng)液保證每孔溶液約3.5 mL左右進行培養(yǎng)。當細胞數(shù)量鋪滿培養(yǎng)板面積的85%～95%左右進行傳代培養(yǎng)。小鼠成骨細胞傳代時,先用適量滅菌Hanks緩沖液清洗細胞2～3次,隨后用1 mL胰酶消化80 s左右,隨后加入2×胰酶溶液體積的細胞培養(yǎng)液,輕輕吹打幾下后將細胞混合溶液轉(zhuǎn)移到離心管中,1200×g下離心2 min。倒上清,加入新的培養(yǎng)液后小心吹打均勻,隨后分裝到新的細胞培養(yǎng)板上。MC3T3-E1細胞用α-MEM完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 U/mg青霉素和100 μg/mL鏈霉素)在37 ℃,5% CO2和濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

制備CS及GO/CS膜:取1 g CS溶解于100 mL濃度為2%(v/v)的醋酸溶液中,在50 ℃下攪拌2 h溶解,室溫下靜置除去溶液中的氣泡。取適量的1 mg/mL的GO溶液,分別加入EDC和NHS使之最后的濃度為0.03、0.06 mol/L用以活化羧基,攪拌混勻后用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=7.0。將GO溶液和CS溶液混合使二者的質(zhì)量比分別為0∶100、0.5∶100、1∶100和2∶100,即CS膜、0.5% GO/CS膜、1% GO/CS膜和2% GO/CS膜。隨后溶液超聲4 h后備用。將上述溶液分別倒入6孔(1 mL)或是96孔(100 μL)細胞培養(yǎng)板中,50 ℃下晾干。之后用1 mol/L NaOH溶液浸泡CS膜15 min,之后用超純水沖洗3次,再次烘干。使用之前用紫外滅菌30 min。

1.2.4 CS及其復合膜對細胞活性影響 本實驗采用CCK-8試劑盒測定細胞活性的影響。取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞1×105個/mL的細胞懸濁液150 μL放入含有膜的96孔培養(yǎng)板中,放置在培養(yǎng)箱中培育24 h,培養(yǎng)箱的環(huán)境為37 ℃,5% CO2,濕度90%。24 h后棄掉原培養(yǎng)液,再向每孔加入135 μLα-MEM完全培養(yǎng)液+15 μL CCK-8溶液在37 ℃下培育2 h,之后在450 nm波長處用酶標儀檢測OD值。每組設置6組重復,此試驗重復3次。空白組為不加細胞，但是加入135 μL培養(yǎng)液+15 μL CCK-8。

1.2.5 CS及其復合膜對細胞凋亡的影響 采用Annexin V/PI試劑盒檢測。細胞以1×106個/孔接種于上述制備的6孔板上,細胞培養(yǎng)板分為空白組、CS膜、0.5% GO/CS膜、1% GO/CS膜和2% GO/CS膜5組。細胞培育24 h后,用含EDTA的胰酶消化后1200×g離心5 min去上清,用PBS緩沖液重懸,離心去上清,再用PBS緩沖液重懸離心去上清,并且保證每個試驗樣品的細胞數(shù)不少于1×106個。然后加入500 μL的細胞上樣液,5 μL的膜聯(lián)蛋白-V(Annexin V)和10 μL的碘化丙啶(PI),混合均勻。室溫避光反應15 min,為保證實驗效果樣品要在1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

1.2.6 CS及其復合膜對細胞周期的影響 具體過程:取對數(shù)生長期的細胞接種在空白組和CS薄膜的6孔培養(yǎng)板上,細胞的濃度為2×106個/孔;培養(yǎng)24 h后,細胞總數(shù)不少于1×106個/孔,用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞,終止消化后收集細胞,在1200×g離心5 min后去上清,PBS重懸潤洗細胞沉淀1次;1000×g離心5 min,去上清,100 μL PBS重懸細胞,將700 μL預冷的80%乙醇緩慢加入,使乙醇終濃度為70%;4 ℃固定4 h以上;1000×g離心5 min,預冷PBS潤洗2次,隨后加入100 μL RNase(50 μg/mL),37 ℃水浴30 min;加入400 μL PI,4 ℃避光染色30 min;流式細胞儀檢測PI熒光強度。用Cotfit軟件分析G1期、S期、G2期細胞數(shù),計算細胞各周期所占的比例。

增殖指數(shù)PI(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2M)×100

1.2.7 卵黃高磷蛋白對MC3T3-E1細胞增殖的影響 為研究不同濃度卵黃高磷蛋白對細胞影響和磷蛋白與CS膜共同作用細胞的影響,實驗分為兩大組:空白組和CS膜組。在每組中,細胞α-MEM培養(yǎng)液中分別加入0、100、200和500 μg/mL PV進行研究。采用CCK-8試劑盒進行檢測。取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞1×104個/mL的細胞懸濁液150 μL接種到底部有CS膜和沒CS膜的96孔培養(yǎng)板中。待細胞貼壁后,加入含有不同PV濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,隨后盡量吸走上清液,并加入150 μL含有10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基。培育2 h后用酶標儀在450 nm波長處測OD值。

1.2.8 卵黃高磷蛋白對MC3T3-E1細胞凋亡的影響 實驗分為兩大組:空白組和CS膜組。在每組中,細胞α-MEM培養(yǎng)液中分別加入0、100、200和500 μg/mL PV進行研究。取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞1×106個/mL的細胞懸濁液1 mL接種到底部有CS膜和沒有CS膜的6孔培養(yǎng)板中。待細胞貼壁后,加入含有不同PV濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。后續(xù)過程同1.2.5。

1.3 數(shù)據(jù)處理

細胞增殖結(jié)果均用Origin 8.0作圖,用SPSS統(tǒng)計軟件進行t檢驗和方差分析,用Flowjo軟件對流式細胞儀結(jié)果進行分析及作圖,用Cotfit軟件分析細胞周期數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE凝膠電泳分析

卵黃高磷蛋白是一種高度磷酸化的糖蛋白,目前來自雞蛋的卵黃高磷蛋白主要分為α-PV和β-PV。其中,α-PV含有3～4個亞基,分子量為35～40 kDa,而β-PV含有4～5個亞基,主要分子量為45 kDa。圖1表明,卵黃高磷蛋白主要條帶在35 kDa左右,制備的PV主要條帶和Sigma標品的條帶一致。因此,可以用此蛋白進行后續(xù)研究。

圖1 Sigma標準品與提取的卵黃高磷蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE patterns of purified phosvitin from egg yolk compared with Sigma standard phosvitin

2.2 CS及其復合膜對MC3T3-E1細胞活性的影響

CCK-8試劑盒是一種間接測量細胞活性的方法。從圖2可見,與空白對照組(組織培養(yǎng)聚苯乙烯板)相比,CS膜能夠極顯著促進MC3T3-E1細胞增殖活性(p<0.01),提高了31.92%。GO/CS膜則都降低了細胞活性,GO含量越多,細胞活性下降越明顯,GO含量為2%時,細胞活性下降了83.9%。這說明GO對MC3T3-E1細胞增殖有抑制作用,并且呈現(xiàn)劑量依賴性。之前有研究表明，CS具有良好的生物相容性,對SD胎鼠顱骨成骨細胞[23]與間充質(zhì)干細胞[24]無毒性作用。有學者證實了碳基納米材料對不同的細胞有不同的毒害作用[25],此結(jié)果同樣說明了GO對MC3T3-E1細胞有毒害作用。

圖2 CS及GO/CS膜對細胞活性影響Fig.2 Effects of chitosan and graphene oxide/chitosan membrane on cell viability注:不同小寫字母表示差異極顯著(p<0.01);圖4、圖6、圖7、圖9同。

2.3 CS膜及GO/CS膜對MC3T3-E1細胞凋亡的影響

利用流式細胞儀檢測MC3T3-E1細胞在CS及GO/CS復合膜上培育24 h后細胞狀態(tài)的具體情況如圖3。對圖3中正在凋亡和已經(jīng)凋亡的細胞占比總結(jié)得圖4,分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):CS膜組的凋亡率相比空白組顯著下降了45.78%;但是隨著GO的加入,MC3T3-E1細胞凋亡率呈現(xiàn)上升的趨勢,GO含量到2%時,凋亡率到達了17.64%。這個結(jié)果說明，CS能夠降低細胞的凋亡過程,而GO卻對細胞產(chǎn)生毒害作用,加劇了細胞凋亡。此結(jié)果與上面的細胞活性實驗結(jié)果相吻合。

圖3 CS及GO/CS膜對MC3T3-E1細胞凋亡分布影響Fig.3 Effect of chitosan and its graphene oxide composite membrane on the apoptosis of MC3T3-E1 cells

圖4 CS及GO/CS膜對MC3T3-E1細胞總凋亡的統(tǒng)計Fig.4 Statistics of total apoptosis of MC3T3-E1 cells by chitosan and graphene oxide/chitosan membrane

2.4 CS膜對MC3T3-E1細胞周期的影響

細胞周期是說從一次細胞分裂結(jié)束開始到下一次細胞分裂結(jié)束為止的過程。一般來說細胞周期分為:G0期、G1期、S期、G2期和M期。用流式細胞儀檢測培養(yǎng)后的細胞各個周期的比例,如圖5。由于檢測過程中G0期和G1期的DNA數(shù)量相同,流式細胞儀不能區(qū)分兩者各自的檢測值,因此顯示為一個指標,標記為G0/G1。同樣,G2和M也整合成一個指標,標記為G2/M。在細胞整個分裂過程中,S期是指從DNA合成開始到結(jié)束的過程,在細胞分裂過程中起至關重要的作用。如圖6所示,空白組的細胞周期分布為:G0/G1期為69.6%,S期為21.42%,G2/M期為8.98%;在CS膜上培育的細胞周期分布則是:G0/G1期為60.84%,S期為30.63%,G2/M期為8.53%。相比于空白組,CS膜組的G0/G1期細胞比例下降12.59%,S期細胞比例上升了43.00%。此結(jié)果說明,CS膜對MC3T3-E1細胞增殖具有促進作用,這與前面細胞活性實驗結(jié)果吻合。

圖5 CS膜上MC3T3-E1各個細胞周期分布Fig.5 Distribution of the cell cycle of MC3T3-E1 on the chitosan membrane

圖6 CS對MC3T3-E1細胞對各個細胞周期所占的百分比的影響Fig.6 Effect of chitosan on the percentage of MC3T3-E1 cells in each cell cycle

2.5 卵黃高磷蛋白對培養(yǎng)在CS膜上MC3T3-E1細胞增殖的影響

卵黃高磷蛋白是一種高度磷酸化的糖蛋白,與金屬離子有很強的結(jié)合能力。據(jù)報道,體外培養(yǎng)的情況下,卵黃高磷蛋白對人牙髓細胞在10、100 ng/mL濃度下均能促進該細胞增殖,而在1 μg/mL的濃度下則產(chǎn)生抑制作用[26]。由于相同濃度的卵黃高磷蛋白對不同的細胞的影響效果不同,此次實驗選擇的濃度參考本實驗室之前的研究結(jié)果[27]。根據(jù)圖7可以看出,卵黃高磷蛋白對MC3T3-E1細胞增殖影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。殼聚糖膜上，低濃度卵黃高磷蛋白(100 μg/mL)對細胞增殖促進作用最明顯，為181.59%，上升81.59%；當?shù)鞍诐舛鹊竭_200 μg/mL時，和100 μg/mL蛋白濃度相比促進作用下降，但是與空白組(0 μg/mL蛋白濃度)相比，仍然顯示出顯著促進作用(p<0.05)；而蛋白濃度達到500 μg/mL則出現(xiàn)了對細胞增殖的抑制現(xiàn)象，細胞增殖僅為95.53%，下降了4.47%。空白組蛋白濃為500 μg/mL細胞增殖率最低，為61.36%。這說明卵黃高磷蛋白促進該細胞增殖的最佳濃度在100 μg/mL附近。綜合Liu等[28]的研究,推測卵黃高磷蛋白促進細胞增殖可能是通過促進細胞分裂前期S期的細胞比例實現(xiàn)的。而CS對不含PV的組促進作用明顯,在低、中濃度蛋白的情況下促進作用不明顯,在高濃度蛋白下則產(chǎn)生了抑制的現(xiàn)象。

圖7 不同PV濃度在不同基質(zhì)上對細胞增殖的影響Fig.7 Effects of different concentrations of PV on cell proliferation in different substrates

2.6 卵黃高磷蛋白對培養(yǎng)在CS膜上MC3T3-E1細胞凋亡的影響

圖8是卵黃高磷蛋白作用細胞24 h后經(jīng)過Flowjo軟件分析處理后的處在不同細胞時期的圖像。分析圖9發(fā)現(xiàn),卵黃高磷蛋白對空白組和CS膜組產(chǎn)生的趨勢是一致的。相比與不添加卵黃高磷蛋白組,添加了100、200 μg/mL卵黃高磷蛋白會顯著抑制細胞凋亡(p<0.05);而當?shù)鞍诐舛冗_到500 μg/mL時,細胞凋亡所占比例顯著增加(p<0.05)。

圖8 CS膜上卵黃高磷蛋白對MC3T3-E1細胞凋亡的影響Fig.8 Eeffect of phosvitin on the apoptosis of MC3T3-E1 cells in chitosan membrane

圖9 CS膜上卵黃高磷蛋白對MC3T3-E1細胞總凋亡的影響統(tǒng)計Fig.9 Statistics of effect of phosvition on total apoptosis of MC3T3-E1 cells on chitosan membrane

3 結(jié)論

殼聚糖能通過促使MC3T3-E1細胞進入分裂周期提高增殖活性,氧化石墨烯對細胞有毒性作用,呈現(xiàn)劑量依賴。因此,殼聚糖適合做MC3T3-E1細胞培養(yǎng)基質(zhì),氧化石墨烯則不適于該細胞后續(xù)研究。在殼聚糖基質(zhì)上,卵黃高磷蛋白在100 μg/mL濃度時促進增殖和抑制凋亡的效果最明顯,在500 μg/mL則開始出現(xiàn)抑制增殖和促進凋亡的效果。這可能與卵黃高磷蛋白的磷酸化有關。該結(jié)果為后續(xù)研究二者共同對MC3T3-E1細胞分化成成骨細胞后影響,為開發(fā)卵黃高磷蛋白的深層利用價值提供依據(jù)。